1、缓冲液的准备
目标蛋白与组氨酸标签蛋白纯化磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，而各种缓冲液配制也将在一
定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此，在较大规模蛋白纯化之前，用户应该自行设计实验，筛选出适合纯
化目标蛋白的缓冲液体系，主要包括 Binding Buffer、 WashingBuffer、 ElutionBuffer。
增加咪唑浓度进行洗脱是组氨酸标签纯化磁珠常用的洗脱方法，使用时，在不确定洗脱咪 唑浓
度情况下，推荐在缓冲液中分别加入 10 mM、 20 mM、 50 mM、 100 mM、 200mM、 300mM、 400 mM、 500 mM
咪唑，浓度从低到高分别洗脱，磁吸后收集蛋白上清液，之后通过 SDS-PAGE 电泳等方法鉴定洗脱结果。
以下提供的缓冲液体系适用于多数组氨酸标签蛋白的纯化，供用户参考。 Binding Buffer： 20 mM 磷酸缓冲液，
0~50 mM 咪唑， pH7.4 ； WashingBuffer： 20 mM 磷酸缓冲液， 50~100 mM 咪唑， pH7.4； Elution Buffer： 20mM
磷酸缓冲液， 100-500 mM 咪唑， pH7.4；
2、 磁珠预处理
预估蛋白表达量， 根据 30-40μg/mg 蛋白的结合量投入合适量的磁珠， 假如预估表达量为 10-20mg， 那么需要投入
500mg 的磁珠；
利用磁铁或者磁力架去除磁珠保存液， 加入保存液相同体积的 Bingding Buffer 清洗 3 次， 每次上下翻转 10-20 次，
去除上清液； 建议磁性分离时间为 30-60s。
3、 目标蛋白与磁珠的结合
加入目标蛋白样品（建议目标粗蛋白溶液与 Binding Buffer 相同， 如过不同， 建议使用超滤或者透析的方式进行 Buffer
替换）， 震荡混匀 30s， 室温或者冷藏旋转混匀 10-30 分钟（如果目标蛋白温度稳定性差， 可在冷藏条件下进行， 适
当增加结合时间至 1-2 个小时）。
4、 磁珠洗涤
加入合适体积的 Washing Buffer（建议体积为 1-2mL/100mg） ， 颠倒混匀数次， 磁性分离， 去除上清， 重复操作 3-
5 次直至没有杂蛋白出现（建议使用分光光度计 OD280 进行质量控制）；
5、 目标蛋白洗脱
用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度，加入合适体积的 Elution Buffer，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬
浮，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品； 如果需要，可以重复上述步骤 1 次，收集
样品到新的离心管中，以检测目标蛋白是否洗脱*。
6、 磁珠后处理
（1）在装有磁珠的离心管中加入 2mL/100mg 的 500mM 咪唑，上下翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，去
除上清液。
（2）重复上述步骤 2 次。
（3）在离心管中加入 2mL/100mg 的 ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，去除上清液。
（4）重复上述步骤 2 次。
（5）加入 Storage Buffer 到磁珠中使总体积为 1 mL/100mg，保存于 2~30℃（长期保存，置于 2~8℃），可用于
下一次同种蛋白的纯化。
7、 磁珠再生
磁珠连续使用三次以上，其结合目标蛋白的能力可能会明显降低，建议进行磁珠再生处理。
Stripping Buffer： 20 mM 磷酸缓冲液， 500 mM NaCl， 100 mM EDTA， pH7.4
Beads Washing Buffer（可选）： 0.5 M NaOH， 2 M NaCl
Recharge Buffer： 100 mM NiSO4（该化学试剂有一定的毒性，可能造成过敏反应，使用时务必注意）
Storage Buffer： 20%（v/v）乙醇
以 5 mL （500mg） 磁珠悬液为例，详细说明磁珠再生操作：
（1）将磁珠悬液进行磁性分离，去除上清液，从磁性分离器上取下离心管，在离心管中加入 5mLddH2O， 上下翻
转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。（2）加入 5 mL Stripping Buffer，上下翻转离心管数次，
使磁珠重新悬浮，室温旋转混合 5min，磁性分离，去除上清液。重复此步骤 1 次。
（3）加入 5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液，重复此步骤 2 次。
（4）碱处理： 加入 5 mL Beads Washing Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合 5 min，
磁性分离，去除上清液。加入 5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。重
复 ddH2O 洗涤步骤 3~5 次，至洗涤液呈中性为止。（5）加入 5 mL Recharge Buffer，上下翻转离心管数次，使
磁珠重新悬浮，室温旋转混合 20min，磁性分离，去除上清液。
（6）加入 5 mL ddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。重复此步骤 6 次以上，
保证镍离子去除*。
（7）加入 Storage Buffer 到磁珠中使总体积为 5 mL，保存于 2~30℃（长期保存，置于 2~8℃）。