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【微课堂】环氧乙烷灭菌生物指示剂芽孢计数方法

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2024/8/27 16:06:09

《药品GMP指南》生物指示剂的应用中指出，实验室在接受商品化生物指示剂时，应进行微生物数量测定。

那么，环氧乙烷灭菌生物指示剂的总芽孢数是如何确定的呢？接下来为大家分享泰林环氧乙烷灭菌生物指示剂（Bacillus atrophaeus ATCC9372）的芽孢计数方法。

环氧乙烷灭菌生物指示剂芽孢计数—操作方法

随机抽取需检验批次环氧乙烷灭菌生物指示剂取4片（支）放置于提前照过紫外的生物安全柜中（相关物品已放置于生物安全柜中），用酒精棉擦拭指示剂外表，通风15min以上，后续操作如下：

注意：生物指示剂不要进行紫外照射，可能会造成计数结果偏低！！！

01 芽孢洗脱

在生物安全柜中，取4片（支）生物指示剂打开，取出载体，分别放置于含有3-4颗玻璃珠（直径6mm）的无菌试管中，向无菌试管中加入3mL的含0.1%聚山梨酯80的无菌纯化水，置于涡旋混匀仪上充分振荡，将试管中载体打散成纤维装后，再中加入7mL含0.1%聚山梨酯80的无菌纯化水，震荡30s，制成均一的菌悬液，将该试管记为10^-1。

02 热激活

将水浴锅加热至80℃-85℃，取上述试管，放置于水浴锅中热激活10min，热激完成后，立即将芽孢悬液转移至0-4℃的冰水浴中冷却至室温。

03 梯度稀释

将该试管转移至生物安全柜中，于旋涡混匀仪上旋涡30s，用移液枪吸取1mL芽孢悬液，加入到另一根含有9mL含0.1%聚山梨酯80的无菌纯化水的试管中，记为10^-2，按照该方法依次稀释至10^-3、10^-4（稀释级别按制造商提供的芽孢数量而定）。

04 制备计数平皿

取芽孢数在30cfu/mL-300cfu/mL的稀释级别的试管（10^-4）震荡30s，每支稀释管平行制备2个平皿，每皿加1mL菌悬液，注入15mL-20mL温度不超过45℃融化的胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）。等待琼脂凝固后，倒置于30℃-35℃培养箱中培养48h-72h后计数。

05 计算

总芽孢数cfu/片（支）=平均菌落数×稀释倍数。

06 判定标准

（Bacillus atrophaeusATCC9372）的菌落圆形、凸面、粗糙、不透明，颜色呈淡黄色或淡橘色，菌落生长状态良好，单一，无杂菌。总芽孢数结果应在产品标示值的50%-300%范围内。

注意事项

1、切勿将生物指示剂进行紫外照射消毒，建议对初级包装进行擦拭。

2、环氧乙烷灭菌生物指示剂芽孢计数，建议使用含0.1%聚山梨酯80的无菌纯化水进行稀释。

3、吸取含纸质载体的菌液时，避免纤维堵枪头，导致移液不准确。

4、建议以单片（支）生物指示剂的形式进行计数，确保每片（支）生物指示剂计数结果均符合要求。

5、建议使用玻璃珠（4mm-6mm）对纸质载体进行打散处理。

6、芽孢计数过程中必须进行热激活处理：温度80℃-85℃，时间10min。

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