【微课堂】泰林压力蒸汽灭菌生物指示剂芽孢计数方法-制药网-手机版

《药品GMP指南》生物指示剂的应用中指出，实验室在接收商品化生物指示剂时，应进行微生物数量测定。

那么压力蒸汽灭菌生物指示剂的总芽孢数是如何确定的呢？接下来为大家分享泰林压力蒸汽灭菌生物指示剂的芽孢计数方法（121℃灭菌生物指示剂均选用嗜热脂肪地芽孢杆菌 Geobacillus stearothermoρhilus ATCC7953）。

随机抽取需检验批次生物指示剂4片（支）与相关物品一并放入生物安全柜中，用酒精棉对指示剂初级包装进行擦拭，通风15min以上，后续操作如下：

注意：物料准备过程中，切勿使用紫外照射生物指示剂，可能会导致计数结果偏低。

01 指示剂处理：

纸质载体生物指示剂

将生物指示剂转移至生物安全柜内，取出载体，加入到含3~4颗4mm~6mm玻璃珠和3mL无菌水的试管中，置于涡旋混匀仪上充分振荡，将试管中载体打散成纤维状后，再加入7mL无菌水，制成均一的菌悬液，该试管记为10^-1（同步平行4片）。

悬液式生物指示剂

将悬液式生物指示剂（安瓿管式，规格：1mL/支）置于涡旋混匀仪上混匀，用安瓿开启器打开安瓿管移取0.5mL菌悬液，置含4.5mL无菌水的试管中混匀，该试管记为10^-1。

将悬液式生物指示剂（直管式，规格：0.3mL/支），用直管切割器打开置于含9.7mL无菌水的试管中，置于涡旋振荡仪上混匀，该试管记为10^-1。

02 热激活处理

将上述10^-1试管放置于95℃～100℃恒温水浴锅中热激活15min，热激活结束后立即放入 0℃～4℃冰水混合浴中迅速冷却至室温。

03 梯度稀释（10⁶浓度）

梯度稀释操作流程图（载体式示例）

注：根据生物指示剂总芽孢数适当调整稀释级，建议最终稀释芽孢数在30~300cfu/mL。

压力蒸汽灭菌生物指示剂稀释倍数对照表

04 培养计数

取最终稀释的试管，用移液枪吸取1mL菌悬液加入90mm的一次性无菌平皿中，注入15mL ~20mL温度不超过45 ℃融化的胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），混匀，每稀释级至少制备2个平板。等待平板凝固后，倒置于恒温培养箱中55℃~60℃培养24h~48h，记录各平板的菌落数，并计算每片（支）生物指示剂的总芽孢数。