REAGEN 卡那霉素试剂盒

1．概述

REAGEN™ 卡那霉素酶联免疫反应测试盒是用于细胞裂解液、培养液、质粒等样本中卡那霉素残留的定量检测。该试剂盒有以下特点：

Ø 快速(10-40分钟)，多种样品的非有机溶剂的提取方法，高回收率(>80%)。

Ø 高灵敏度（0.2ppb）。

Ø 高重复性。

Ø 快速的ELISA检测方法（不考虑样本量的前提下只需不到1小时）。

2.试剂盒原理

REAGEN™ 卡那霉素酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，抗原已经包被于微孔板上。分析时，样品、酶标物以及抗体加入孔中，如果样品中含有药物，会与微孔板上的抗原竞争抗体，同时酶标物与抗体结合。加入TMB底物，底物的颜色显色强度与样品中卡那霉素的含量成反比。

3.试剂盒组成

已包被抗原的酶标板(Kanamycin-coated Plate)（可拆式） 1×96孔

标准液(Standards)（0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2ppb） 6×1.0mL

高标液1000ppb（Spiking） 1×1.0mL

一抗(Antibody #1) 1×6.0mL

HRP酶标二抗(HRP-Conjugated Ab#2) 1×6.0mL

10×样品稀释液（10×Sample diluent） 1×15mL

20×浓缩洗液(Wash Solution) 1×28mL

TMB底物(TMB Substrate) 1×12mL

终止液(Stop Buffer) 1×12mL

    本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。如果超过1个月不使用试剂盒，请将标品、一抗和二抗放置-20℃或者冰冻保存。

4.检测限

5.交叉反应

6.未提供的设备或材料

1) 酶标仪

2) 离心机

3) 漩涡振荡器

4) 移液器(10、20和100mL，1mL各一支)

5) 多道移液器（50-300mL）

7.注意事项

实验前请阅读以下文字，以保证获得最佳实验效果。

1) 标准品中含有卡那霉素，请小心使用。

2) 不要使用过期的试剂盒。

3) 不同批次的试剂盒不要混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。

4) 尽量保持室温20-25℃，避免在通风口操作防止温度过低，过热或者蒸发。同样的，不

要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。

5) 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。

6) 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。

7) 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。

8) 从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。

9) 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。

8.样品的准备

确保样品的正确保存，一般来说，样品在2-4只能保存1-2天，如果要保存更长时间，就要保存在-20冷冻保存，在用之前需要将冷冻的样品在室温下或冰箱内解冻。

准备1×样品稀释液:

1体积 10×样品稀释液加9体积蒸馏水稀释。

细胞裂解液/培养液/质粒

（1） 取200mL细胞裂解液等样本，涡流震荡混匀30秒；

（2） 4000×g离心5分钟；

（3） 每孔取50mL上清液来检测。

稀释倍数:1

9.检测步骤

注意：试剂在使用之前要在室温下解冻1-2小时，确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶子中，处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。

1) 1x洗液的制备

1体积的20x洗液同19体积的蒸馏水混合。

检测

以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。

 （（1）加入50mL的标准品于所设定的孔中；

（2） 加入50mL的样品于所设定的孔中；

（3） 按顺序在每孔中加入50mL HRP酶标二抗和50mL一抗，轻敲微孔板边缘混匀30秒；

（4） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟；

（5） 洗板4次，每次应该加入250mL 1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上拍干；

（6） 加入100mL的TMB底物；计时，轻敲微孔板边缘混匀30秒；

（7） 在室温（22.5±2.5）°C避光孵育15分钟，加入100mL的终止液终止反应；

（8） 在450nm下读OD值 (读数前，最好用无绒布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。

10.结果计算

（1） 分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。

相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ´ 100

（2） 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。

（3） 从标准曲线上读取样品的浓度值（通用计算软件根据Log/Log标曲看线性和结果）。

以下曲线图是卡那霉素酶联免疫反应测试盒典型标准曲线