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罗非鱼ELISA检测试剂盒用途
该试剂盒用于体外定量检测血清、血浆或其他相关生物液体中浓度。
罗非鱼ELISA检测试剂盒检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的抗原会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗体与结合在包被抗体上的抗原结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，抗原浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中指标的浓度。
| 反应类型 | 夹心法 |
| 规格 | 96T |
| 反应时间 | 4.5h |
| 反应性 | 通用 |
| 检测方法 | Colormetric |
| 灵敏度 | 检测下线除以10 |
| 样本体积 | 100μL |
| 样本类型 | 血清、血浆或其他相关生物液体 |
| 特异性 | 可检测样本中的指标,且与其它相关蛋白无明显交叉反应 |
| 重复性 | 板内，板间变异系数均<10% |
样品活化方法
生物样品中的通常以无活性的形式存在，在检测指标活性前必须进行活化处理。
活化方法如下：
血清、血浆： 280 μL标准品&样品稀释液中加入40 μL样品，混匀，加入40 μL活化试剂1，室温孵育10分钟。再加入40 μL活化试剂2，混匀后立即检测。
注意：样品被稀释了10倍！
细胞培养上清：20 μL标准品&样品稀释液中加入100 μL样品，混匀，加入40 μL活化试剂1，室温孵育10分钟。再加入40 μL活化试剂2，混匀后立即检测。
注意：样品被稀释了2倍！
组织匀浆：1960 μL标准品&样品稀释液中加入40 μL样品，混匀后检测。
注意：样品被稀释了50倍！
精密度
板内精密度:低浓度样本,中浓度样本和高浓度样本分别在1块板子上检测20次。板间精密度:低浓度样本,中浓度样本和高浓度样本分别在3块板子上检测20次。
| 批内变异系数 | 批间变异系数 | |||||
| 样本 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 |
| 数量 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| 平均值( MERGEFIELD 单位ng/mL) | 0.41 | 1.07 | 4.96 | 0.47 | 1.25 | 4.24 |
| 标准差 | 0.02 | 0.05 | 0.22 | 0.03 | 0.06 | 0.2 |
| 变异系数 (%) | 4.88 | 4.67 | 4.43 | 6.38 | 4.8 | 4.72 |
回收率
分别往5个不同样本中添加已知浓度的目标蛋白，做回收实验，得出回收率范围和平均回收率。
| 样本类型 | 回收率范围 (%) | 平均回收率 (%) |
| 血清(n=5) | 94-110 | 102 |
| 血浆(EDTA)(n=5) | 90-102 | 96 |
| 细胞上清(n=5) | 95-106 | 98 |
线性
分别往5个样本中添加已知浓度的目标蛋白，做回收实验，得出回收率范围及平均回收率。将5个样本分别稀释2倍，4倍，8倍，16倍做回收实验，得出回收率范围及平均回收率。
| 血清(n=5) | 血浆(EDTA)(n=5) | 细胞上清(n=5) | ||
| 1:2 | 回收率范围(%) | 99-108 | 95-105 | 92-104 |
| 平均回收率(%) | 105 | 102 | 97 | |
| 1:4 | 回收率范围(%) | 95-109 | 90-100 | 97-105 |
| 平均回收率(%) | 102 | 96 | 100 | |
| 1:8 | 回收率范围(%) | 89-103 | 89-104 | 96-108 |
| 平均回收率(%) | 97 | 97 | 102 | |
| 1:16 | 回收率范围(%) | 88-102 | 98-108 | 92-105 |
| 平均回收率(%) | 94 | 104 | 100 |
试剂盒组成及保存
未拆封的试剂盒可在4℃保存一周；如果一周以后才使用试剂盒，请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。
| 试剂盒组成 | 48孔配置 | 96孔配置 |
| 说明书 | 1份 | 1份 |
| 封板膜 | 2片 | 2片 |
| 密封袋 | 1个 | 1个 |
| 酶标包被板 | 1×48 | 1×96 |
| 标准品 | 0.3ml×6管 | 0.3ml×6管 |
| 酶标试剂 | 5 ml×1瓶 | 10 ml×1瓶 |
| 样品稀释液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
| 显色剂A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
| 显色剂B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
| 终止液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
| 20×浓缩洗涤液 | 15ml×1瓶 | 25ml×1瓶 |
| 试剂盒组成 | 48孔配置 | 96孔配置 |
| 说明书 | 1份 | 1份 |
| 封板膜 | 2片 | 2片 |
| 密封袋 | 1个 | 1个 |
说明：所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。
试剂体积以实际发货版说明书为准。相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出。
操作步骤
1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；。
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
试验所需自备物品
1. 酶标仪(450nm波长滤光片)
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10 μL, 2-20 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL
3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水
4. 吸水纸
