分子垂钓最怕非特异性和低亲和力？Octet来救场！
时间：2023-09-14 阅读：2138
适配子(Aptamer)是对某个靶点分子有特异结合的DNA或RNA寡核苷酸，因其特殊的分子识别能力在诊断和治疗应用中具有巨大的潜力。然而，高亲和力和高特异性的核酸适配子往往不容易获得。适配子一般是通过SELEX方法从核酸库中进行筛选，这个方法依赖于将靶点分子固定在某个固相，再去钓取潜在与靶点结合的适配子，但是固化有可能导致的空间位阻限制了靶点和适配子结合的自由度。
背景与实验设计
近期的一篇文章中，四川大学生命科学学院黄震组先将靶点生物素化，然后将生物素靶点(HPV L1蛋白)和适配子在液相中混合形成适配子-靶点复合物，再用偶联链霉亲和素的固相介质(包括磁珠和Octet® 传感器)去抓取这种复合物，并进行洗脱鉴定，这样便成功克服了先固化靶点所带来的不利影响，使得适配体的筛选效率显著提升，该方法被称之为 Free Aptamer-ligand Interaction (FRARI)[1]。
图1. FRARI示意图：通过多轮FRARI循环，富集和筛选到高亲和力的适配子
本篇文章在筛选适配子过程中做了2个不同维度的比较：
1 SELEX, Octet® (BLI法，生物层干涉), 和MB (磁珠法)三种方法的比较；
2 随机生物素化靶点和定点生物素化靶点的比较：前者通过靶点蛋白的氨基随机共价偶联生物素，后者通过Avi tag在N端进行定点生物素化，原则上后者可以更好地保持靶点的天然结构。
Octet® 的实验方法与结果
将生物素化靶点和DNA文库室温下孵育1小时。然后，使用Octet® 的SA传感器与混合物孵育50分钟来捕获形成的复合物。用PBS洗涤两次(一次600秒，一次120秒)后，将捕获的复合物传感器用蛋白酶K(1.8μL，20mg/mL)52°C中消化2小时。接下来，扩增、制备次轮文库，进行多轮筛选后测序鉴定。
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| 图2. SELEX, MB, Octet® 三种方法比较(定点生物素化法)：SELEX 九轮富集的特异适配子丰度(a)远远低于FRARI方法，包括BLI(b)和MB(c) |
对比发现，Octet® 法和MB法在进行6轮筛选后便能富集获得特异性适配子，而在经过9轮筛选后，Octet® 法和MB法均实现了高丰度的特异性适配子富集。并且基于FRARI的Octet® 法筛选出的几个高亲和力适配子与基于MB法筛选的结果是一致的。更关键的是，Octet® 法丰度的区分度更好，比如最高丰度的一个适配子(蓝色)占绝大多数，随后的实验也证实该适配子具有更强的亲和力，说明Octet® 可以更好地区分特异性适配子的亲和力。
方法验证
Octet® 筛选出的丰度好的适配子(S4)亲和力是否强呢？作者将生物素化的适配子固化在链霉亲和素(SA)传感器上，与靶点蛋白进行结合解离，以计算结合动力学参数。
图3. Octet® 法筛选出的适配子与靶点亲和力，可见S4的亲和力最高，KD值达到几十nM
随后作者使用Octet® 法筛选的适配子成功建立了基于夹心法的HPV临床诊断方法，实现了临床样品中HPV的检测，进一步证明这些适配子的强亲和力和特异性。
Octet® 传感器不仅适合FRARI法，而且相对MB法，Octet® 可以排除许多低亲和力适配子，这可能是因为BLI传感器具有较少的表面积和非特异性结合。因此，Octet® 为核酸适配体的选择提供了高效率的筛选方法。
最近广西大学发表的一篇文章中，开发了一种便携式、独立的核酸适配子传感器用于检测蝗虫信息素4-乙烯基苯甲醚(4VA)，以监测蝗虫种群动态，实现蝗灾预警。使用Octet® 的垂钓方法获得了针对4VA的KD值为269.25±90.65nM的高亲和力适配子，并用此来建立传感器检测方法。
图4. 使用Octet® 传感器固化4-乙烯基苯甲醚(4VA)，结合适配子库，然后用不同强度方法洗脱与4VA结合的适配子
表1. Octet® 筛选的适配子用Octet®进行亲和力测定
Octet® 不仅可以用于垂钓，也可以用于亲和力的验证哦！
Octet® 用于亲和力验证的优点在于：
• 非标记Direct Binding是趋势，不需要标记和信号放大，可以更好地保持反应物的活性
• 快速测定亲和力，提供结合速率常数和解离速率常数更加定量化地表征分子互作
• 无洗涤步骤，可测弱亲和力(解离快)
• 写入了美国药典，文章多，认可度广
• 万金油技术，可以用与检测DNA，小分子，蛋白质等各种生物分子
• 操作简便，耗材及维护成本低
大家大胆地使用垂钓神器 Octet® 非标记分子互作系统去发现未知世界吧！
-参考文献-
【1】Highly-efficient selection of aptamers for detecting various HPV subtypes in clinical samples.Talanta 2023. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2023.125039
【2】Development of functional nucleic acid sensor for detection of locust pheromone 4-vinylanisole.Chemical Engineering Journal 466 (2023) 143065