水果花粉媒介超声波处置数值的选取
时间：2013-01-10 阅读：1534
1材料和方法11花粉采集供试葡萄品种为玫瑰香和瑰宝，试材取自山西省农业*果树研究所葡萄资源圃。采集两供试品种即将开放的花朵，摘下花蕾，在室温下阴干捻碎过筛，收集筛好的花粉，保存于4冰箱内。
12质粒提取采用碱裂解法提取含有GUS报告基因的质粒。
13缓冲液制备缓冲液选用25蔗糖，50mg/LH3BO3，500mg/LCa（NO3）2、4H2O，200mg/LMgSO4、7H2O，100mg/LKNO3。固体培养基是在其中加1的琼脂。
14超声波处理选择功率、处理时间、间隔时间和处理次数4个超声波处理参数为试验因素，破碎（恒硕超声机械专业创新缔造世界*品牌）率和萌发率为测定指标，按四因素二次回归正交组合旋转设计确定试验方案（，2）。拟通过该组试验获得超声波处理参数的*组合，并考察因素效应和因素间交互作用的显著性。花粉进行超声波处理时均是取002g花粉在1mL液体缓冲液中按试验方案处理。
处理后的花粉，一部分直接滴在载玻片上，显微镜下观测花粉的破碎率；另一部分播在固体培养基中，在25恒温下培养2h，显微镜下观测花粉的萌发率。
花粉萌发以花粉管伸长超过花粉直径为标准。
花粉萌发率=萌发花粉数/总花粉数？100；花粉破碎率=破碎花粉数/总花粉数？100.
15GUS检测加质粒处理后的花粉在固体培养基培养2h后，在37恒温下经XGluc染色液染色，显微镜下观测染色情况。染色液成分为1mg/mLXGluc，05mmol/LK3[Fe（CN）6]，05mmol/LK4[Fe（CN）6]，003Triton100，01mol/L磷酸缓冲液（pH70）。
2结果与分析21超声波处理参数的选择从可以看出，花粉破碎率过高会大大影响花粉的萌发，而较低的花粉萌发率直接影响坐果率。
但破碎率过低，说明强度小，质粒进入花粉的几率就会大大降低。因此，只有选择适宜的破碎率，才可兼顾萌发率和质粒导入的要求，选出*处理参数。
采用SAS软件对试验结果进行分析，结果表明，超声波处理的功率、处理时间和处理次数对花粉破碎率和萌发率有极显著影响，而间隔时间对花粉破碎率和萌发率的影响不显著，同时功率与处理时间的交互作用显著，处理时间与处理次数的交互作用极显著。
考察显著性检验结果，试验花粉破碎率和萌发率的稳定性，在不破坏DNA的基础上，超声波处理参数以功率100120W，处理时间45s，间隙时间26s，处理次数6为*组合选择范围。
22GUS检测花粉和质粒混合后使用较优的超声波参数进行处理，即功率100120W，处理时间5s，间隙时间5s，处理次数6.花粉经处理后，在固体培养基中培养一段时间后用XGluc染液37恒温进行染色，如果花粉中转入GUS基因，则花粉及花粉管显蓝色。
本试验中，在对照中没有检测到内源GUS活性，处理检测到花粉显蓝色均为基因导入GUS内，检测到花粉的转化率为4.
3讨论葡萄花粉结构的特殊性造成质粒进入花粉困难。在扫描电镜下观测到葡萄绝大部分品种的花粉萌发孔属三沟孔类型，也就是说这些品种的花粉壁上有3条沟，萌发孔位于3条沟里，萌发孔上都附有乳头状突起，当花粉开始萌发时，这个附着物脱落并在这个位置上显露出圆环状的洞，以利花粉的萌发。因此使用超声波处理使质粒进入花粉内有一定的困难，几率相对其他果树低许多。
葡萄花粉含有很多酶、蛋白质、核酸及其他有生命活性的物质，这些物质在花粉保存过程中极易变性，从而导致花粉生活力下降以致丧失。干燥花粉在0保存30d生活力下降56394。本试验中使用的花粉未经保存时的萌发率为4550，进行超声波处理参数选择时，花粉因保存在4冰箱中时间长，生活力已下降至30.不经过任何处理时，花粉的破碎率为2541，萌发率为1953.
花粉萌发过程中，花粉和柱头释放的核酸酶均降解外源DNA，可能是导致转化失败的重要原因之一。温度、pH和一些化学试剂能影响花粉中核酸酶活性。如：提高培养基中EDTA或MgSO4浓度等；KNO3或PEG可抑制DNA酶活性而不影响转化后花粉的萌发。因此，在试验中应尽量降低花粉萌发过程中核酸酶活性，获得高频率稳定转化。
植物组织中是否存在内源GUS，关系到在植物遗传转化实验中使用GUS报告基因的可靠性。GUS组织化学检测的条件因材料而异，细菌GUS通常在pH70的条件下检测，而植物内源GUS活性检测的pH则有不同的报道。本试验中葡萄花粉在pH70条件下没有检测到内源GUS活性，大大提高了试验的可靠性。
超声波处理各参数对花粉有极显著影响，而且参数间存在交互作用。因此，用超声波处理选择参数时，应考虑其交互作用。各种植物花粉的大小、形态、花粉壁结构及花粉表面的附着物均对质粒进入花粉内部有极大的影响，因此针对不同种植物、同一植物不同品种，均应选择合适的培养基和超声波处理参数，使得利用花粉作为外源基因的载体进行遗传转化有更高的转化效率。