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注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

二氢黄酮醇还原酶是类黄酮合成途径中的一个关键酶，在决定植物的花色、叶色、果色和其他经济器官的色泽及其营养品质方面起着重要作用。

测定原理

二氢黄酮醇还原酶作用于二氢槲皮素产生儿茶素，可与缩合形成红色化合物，在500nm处有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品

研钵、低温离心机、震荡仪、氮吹仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、无水乙醇、乙酸乙酯。

试剂组成和配制

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体12mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体1.5mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加2mL蒸馏水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：液体30mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定操作表

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至500nm。

2. 操作表

酶活性计算公式

1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y=0.0184x+0.0002，R2=0.999

（1）按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在30℃，pH7.5条件下，每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。

DFR活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0184×V反总÷（V样×Cpr）÷T÷2

= 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活性定义：在30℃，pH7.5条件下，每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。

DFR活性（mmol/min/g 鲜重）= （△A-0.0002）÷0.0184×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T÷2

= 9.06×（△A-0.0002）÷W

V反总：反应总体积，1mL；V样：反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min

b．用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y=0.0092x+0.0002，R2=0.999

（1）按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在30℃，pH7.5条件下，每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。

DFR活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0092×V反总÷（V样×Cpr）÷T÷2

= 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活性定义：在30℃，pH7.5条件下，每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生1mmol儿茶素所需的酶量为一个酶活力单位。

DFR活性（mmol/min/g 鲜重）= （△A-0.0002）÷0.0092×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T÷2

= 9.06×（△A-0.0002）÷W

V反总：反应总体积，1mL；V样：反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min

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