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货号 | 产品名称 | 规格 |
AS632143 | 单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测试盒 | 100管/96样 |
AS632143 | 单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测试盒 | 50管/48样 |
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
MDHAR催化MDHA还原生成AsA,在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。
测定原理:
MDHAR 催化 NADH 还原MDHA 生成 AsA和NAD+,NADH在340 nm有特征吸收峰,但是NAD+没有。通过测定340 nm光吸收下降速率,来计算出MDHAR活性。
实验中所需仪器及设备:
研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和双蒸水
试剂组成和配置:
试剂一:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体20mL×1瓶,室温保存。
试剂三:粉剂×1瓶(棕色),4℃保存。临用前加入3 mL蒸馏水充分溶解。
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解。
试剂五:液体15μL×1瓶,4℃保存。临用前加3 mL试剂二充分溶解。
粗酶液提取:
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);8000g ,4℃离心20min,取上清液置冰上混匀待测。
3. 血清等液体:直接测定。
MDHAR测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到340 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二在25℃水浴锅中预热30 min。
3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL试剂三、20μL试剂四、20μL试剂五和120μL试剂二,最后加入20μL上清液,迅速混匀后于340nm比色,记录30s和150s的吸光值30s和150s的吸光值A1和A2,△A=A1-A2。
MDHAR活性计算公式:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
MDHAR活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T
= 804×△A ÷Cpr
(2). 按样本质量计算
MDHAR活性单位定义:25℃中每克样本每分钟氧化1nmol NADH 为1U。
MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×109]÷(W×V样÷V样总)÷T
= 804×△A ÷W
(3)按细胞数量计算
MDHAR活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 804×△A ÷ 细胞数量
(4)按液体体积计算
MDHAR活性单位定义:25℃中每毫升液体每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反总×109÷V样)÷T
= 804×△A
ε:NADH摩尔消光系数,6220 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4L;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W :样品质量;T:反应时间,2min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下:
(1). 按蛋白浓度计算
MDHAR活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T
= 1608×△A ÷Cpr
(2). 按样本质量计算
MDHAR活性单位定义:25℃中每克样本每分钟氧化1nmol NADH 为1U。
MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V反总×109]÷(W×V样÷V样总)÷T
= 1608×△A ÷W
(3)按细胞数量计算
MDHAR活性单位定义:25℃中每104个细胞每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反总×109÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
= 1608×△A ÷ 细胞数量
(4)按液体体积计算
MDHAR活性单位定义:25℃中每毫升液体每分钟氧化1nmol NADH 为1个酶活单位。
MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反总×109÷V样)÷T
=1608×△A
ε:NADH摩尔消光系数,6220 L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4L;V样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒;W :样品质量;T:反应时间,2min。
注意事项:
临用前配制的试剂未使用完的4℃保存,3天内使用完。
公司正在出售的产品:
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