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测定意义：

在食品中，亚硝酸盐可与肉品中的肌红素结合而更安定，在食品加工业中作为保色剂，以维持肉制品的良好外观，并防止肉毒梭状芽孢杆菌的产生，提高食用肉制品的安全，但是人体长期摄入亚硝酸盐过量的食品，可诱发消化系统癌变。

测定原理：

在酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸反应生成重氮化合物，再与N-1-萘基乙二胺形成紫红色偶氮化合物，在540nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵或匀浆器、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液一：液体50 mL×1瓶，室温保存。

提取液二：液体50 mL×1瓶，室温保存。

提取液三：液体50 mL×1瓶，室温保存。

粉剂四：粉剂 100 mg ×1支，室温保存。

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。

样品处理：

称取样品约0.2g鲜重或0.05g干重，破碎，加入0.5 mL 提取液一，沸水浴15min，冷却至室温，加入0.5 mL提取液二，震荡摇匀，加0.5 mL 提取液三，用镊子加少量粉剂四（约1 mg），静置30min，25℃，8000g离心15 min，取上清液待测。

测定步骤和操作表：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2. 操作表

注意：空白管只需测定一次。

亚硝酸盐含量计算：

1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y=0.234x + 0.0002，R2= 0. 999  x为标准品亚硝酸浓度（μg/ml） y为吸光值A。

NO2-（μg/g）=（△A-0.0002）÷0.234×V样÷（V样÷V样总×W）×0.6668

                     =（A – 0.086）÷0.234×1.5×0.6668÷W

                     =4.27×（△A-0.0002）÷W

V样总：加入提取液体积，1.5 mL； V样：反应中样品体积，0.07mL；W：样品质量，g。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为：y=0.141x +0.095，R2= 0. 9991  x为标准品亚硝酸浓度（μg/ml） y为吸光值A。 

NO2-（μg/g ）=（△A-0.0002）÷0.141×V样÷（V样÷V样总×W）×0.6668

                    =（△A-0.0002）÷0.141×1.5×0.6668÷W

                    =7.09×（△A-0.0002）÷W

V样总：加入提取液体积，1.5 mL； V样：反应中样品体积，0.07mL；W：样品质量，g。

注意事项：

1. 试剂盒2-8℃保存。

2. 试剂对人体有一定的危害，请穿实验服，戴手套操作。

3. 若检测出得OD值在标准曲线范围外，请将样品进行适当的浓缩或稀释（A540 <0.09浓缩，A540 > 1.5 适当稀释）。

4. 检出限为0.5μg/g。

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