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测定意义：

CA是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA是三羧酸循环第一步反应的产物。

测定原理：

酸性条件下，柠檬酸还原Cr6+生成Cr3+，在545nm处有特征吸收峰；通过测定545nm吸光值的增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。

自备仪器和用品：

低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体×1管，－20℃保存。

试剂四：粉剂×1管，室温保存。临用前配制，加入2mL试剂一，充分溶解。

试剂五：液体×1管，4℃避光保存。

标准品：液体×1管，250μmol/L柠檬酸标准液，4℃保存。

样品中柠檬酸提取：

1. 液体样品中柠檬酸提取：取0.1mL液体加试剂一0.9mL，充分混匀，11000g， 4℃离心10min，取上清液，待测。

2. 组织中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。11000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

3. 线粒体中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，600g/min，4℃离心5min；取上清至另一EP管中，11000g，4℃离心10min，弃上清（此上清液可用于细胞质CA含量测定）；向沉淀中加试剂二200μl，以及试剂三2μl，充分悬浮溶解，11000g，4℃离心10min，取上清液，待测。

4. 细菌、真菌中：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；11000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到545 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一置于30℃水浴中预热30min。

3. 空白管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL蒸馏水，140μL试剂一，20μL试剂四，20μL试剂五，混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A空白管。

4. 标准管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL标准液，140μL试剂一，20μL试剂四，20μL试剂五，混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A标准管。

5. 测定管：取0.5 mL EP管，依次加入20μL上清液，140μL试剂一，20μL试剂四，20μL试剂五，充分混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A测定管。

注意：空白管和标准管只需测定一次。

计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

按液体样品的体积计算

柠檬酸含量（nmol/L）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×样品稀释倍数×V总

= 2500×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

C标准液：250μmol/L=0.25 m mol/L；样品稀释倍数：（0.1 mL样品+0.9mL试剂一）÷ 0.1 mL样品=10；V总：1mL。

按组织质量计算

柠檬酸含量（nmol/g 鲜重）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V总÷W

= 250×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W

C标准液：250 μ mol/L；V总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；W：样品质量，g。

按蛋白含量计算

柠檬酸含量（nmol/mg prot）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷Cpr

= 250×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr

C标准液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白质含量，mg/mL。

按细胞数量计算

柠檬酸含量（nmol/104 cell）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V总÷细胞数量

= 250×(A测定管－A空白管) ÷(A标准管－A空白管) ÷细胞数量

C标准液：250 μ mol/L；V总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；

b.使用96孔板测定的计算公式如下

按液体样品的体积计算

柠檬酸含量（nmol/L）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×样品稀释倍数×V总

= 2500×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

C标准液：250μmol/L=0.25 m mol/L；样品稀释倍数：（0.1 mL样品+0.9mL试剂一）÷ 0.1 mL样品=10；V总：1mL。

按组织质量计算

柠檬酸含量（nmol/g 鲜重）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V总÷W

= 250×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W

C标准液：250 μ mol/L；V总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；W：样品质量，g。

按蛋白含量计算

柠檬酸含量（nmol/mg prot）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷Cpr

= 250×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr

C标准液：250 μ mol/L=0.25μ mol/mL；Cpr：上清液蛋白质含量，mg/mL。

按细胞数量计算

柠檬酸含量（nmol/104 cell）= [C标准液×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V总÷细胞数量

= 250×(A测定管－A空白管) ÷(A标准管－A空白管) ÷细胞数量

C标准液：250 μ mol/L；V总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；

注意事项：

1. 样品处理等过程均需要在冰上进行。

2. 试剂四需现配现用，配置好的一周内使用完；

3. 试剂五为易致癌物质，实验过程中，需佩戴手套，避免试剂五溅到皮肤上。

4. 柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定，如需测定蛋白含量，需另取组织，使用本公司BCA试剂盒进行测定。

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