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测定意义：

海藻糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。由于海藻糖具有的不同于其他碳水化合物的生物学特性，能在干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等恶劣环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害。

测定原理：

蒽酮比色法。具有灵敏度高﹑简便快捷﹑适用于微量样品的测定等优点。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板﹑研钵、浓硫酸（不允许快递）和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 100ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存；

海藻糖提取：

1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3S，间隔10S，重复30次），室温静置45min，振荡3~5次，冷却后，8000g，25℃离心10min，取上清。

2、组织的处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），冰浴匀浆，室温静置45min，振荡3~5次，冷却后，8000g，25℃离心10min，取上清。

3、血清（浆）的处理：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）加入1mL提取液），冰浴匀浆，室温静置45min，振荡3~5次，冷却后，8000g，25℃离心10min，取上清。

测定步骤：

1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至620nm，蒸馏水调零。

2. 调节水浴锅至95度。

3、工作液的配制：临用前在试剂一中加入3.75mL蒸馏水后，缓慢加入21.25mL浓硫酸，不断搅拌，充分溶解，待用；用不完的试剂4℃保存一周；

4、样本测定：取60μL样本和240μL工作液至EP管中，95度水浴10 min（盖紧，防止水分散失），自然冷却至室温，取200uL至微量石英比色皿或96孔板中，在620 nm 波长下记录测定吸光度值A。

注意：由于工作液具有强腐蚀性，请谨慎操作。

      若吸光值大于1，请将样本用提取液稀释后再测定，计算公式中乘以相应的稀释倍数。

海藻糖含量计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 8.8976x+0.0729；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

2、按样本鲜重计算：

海藻糖含量(mg/g 鲜重)= [V1×(A -0.0729)÷8.8976]÷(W×V1÷V2)=0.112×(A -0.0729) ÷W。

3、按样本蛋白浓度计算：

海藻糖含量(mg/mg prot)= [V1×(A -0.0729) ÷8.8976]÷(V1×Cpr)=0.112×(A -0.0729) ÷Cpr。

4、按细菌或细胞密度计算：

海藻糖含量(μg/104 cell)=[1000×V1×(A -0.0729) ÷8.8976]÷(500×V1÷V2)=0.224×(A -0.0729)

5、血清（浆）海藻糖含量计算

海藻糖含量（mg/mL）＝[V1×(A -0.0729）÷8.8976 )÷(V3×V1÷V2)=1.12×(A -0.0729)

1000：1mg/mL=1000µg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，60μL=0.06mL；V2：加入提取液总体积1mL；；V3：加入血清（浆体积），0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为y = 4.4488x+0.0729；x为标准品浓度（mg/mL），y为吸光值。

2、按样本鲜重计算：

海藻糖含量(mg/g 鲜重)=[ V1×(A -0.0729)÷4.4488]÷(W×V1÷V2)=0.224×(A -0.0729) ÷W。

3、按样本蛋白浓度计算：

海藻糖含量(mg/mg prot)= [V1×(A -0.0729)÷4.4488]÷(V1×Cpr)=0.224×(A -0.0729) ÷Cpr。

4、按细菌或细胞密度计算：

海藻糖含量(μg/104cell)=[1000×V1×(A-0.0729)÷4.4488]÷(500×V1÷V2)=0.448×(A -0.0729)

5、血清（浆）海藻糖含量计算

海藻糖含量(mg/mL)=[V1×(A -0.0729）÷4.4488 )÷(V3×V1÷V2)=2.24×(A -0.0729)

1000：1mg/mL=1000µg/mL；V1：加入反应体系中样本体积，60μL=0.06mL；V2：加入提取液总体积1mL；；V3：加入血清（浆体积），0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意：检测限为10μg/g鲜重或0.1μg/ mg prot

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