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测定意义

多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）是一种细胞壁结合蛋白，可以催化果胶分子中α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解，参与果胶的降解，使细胞壁结构解体，导致果实软化，与果实成熟、叶和花的脱落、病原物防御，细胞伸展发育以及木质化有关，在植物抗病性和食品贮藏保鲜领域具有较高的研究价值。

测定原理

多聚半乳糖醛酸酶水解果胶酸生成半乳糖醛酸，具有还原性醛基，与DNS试剂反应生成红棕色物质，在540nm有特征吸收峰，测定540nm处吸光值变化可计算得多聚半乳糖醛酸酶活性。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体8mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。

酶液提取

1．组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。16000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2．细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后16000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

3．培养液：直接检测。

测定操作表

酶活性计算公式

1. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 3.9642x - 0.008；R2 = 0.9996；x为标准品浓度，mg/mL；y为吸光值。

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在40℃，pH6.0条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×Cpr）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：在40℃，pH6.0条件下，每克样本每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG活性（mg/h/g 鲜重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷W

3．按液体体积计算

酶活性定义：在40℃，pH6.0条件下，每毫升培养液每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷V样÷T=2.523×(ΔA+0.008)

4. 按细胞数量计算

酶活性定义：在40℃，pH6.0条件下，每104个细胞每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG活性（mg/h/104cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T

= 2.523×(ΔA+0.008)÷细胞数量    

V反总：反应总体积，0.15mL；V样：反应中样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，0.5h

2. 用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 1.9821x - 0.008，R2 = 0.9996；x为标准品浓度，mg/mL；y为吸光值。

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在40℃，pH6.0条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

PG活性（mg/h/mg prot）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×Cpr）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：在40℃，pH6.0条件下，每克样本每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位（U）。

PG活性（mg/h/g 鲜重）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷W

3．按液体体积计算

酶活性定义：在40℃，pH6.0条件下，每毫升培养液每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位（U）。

PG活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷V样÷T=5.045×(ΔA+0.008)

4. 按细胞数量计算

酶活性定义：在40℃，pH6.0条件下，每104个细胞每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位（U）。

PG活性（mg/h/104cell）=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）÷T

= 5.045×(ΔA+0.008)÷细胞数量

V反总：反应总体积，0.15mL；V样：反应中样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，0.5h

注意事项

煮沸样本建议将样本在沸水中煮沸10分钟，以将酶灭活。

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