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测定意义

维生素B6（Vitamin B6）又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生，在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有极其重要的作用。

测定原理

VB6与4-氨基安替比在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在390nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。

试剂组成和配制 

提取液：液体70mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体1mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。

样本处理

1. 组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30分钟）。

2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入0.6mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心10min，取上清测定。

3. 血清：直接测定。                

测定操作

计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.3635x+0.0205，R2 = 0.9986

1. 按照蛋白含量计算

VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反总÷（V样×Cpr）

                    = 13.76×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反总÷（V样×W÷V样总）

                = 13.76×（△A - 0.0205）÷ W

3. 按照细胞数量计算

VB6含量（μg/104 cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）

                     = 13.76×（△A - 0.0205）÷ 细胞数量

4. 按照液体体积计算

VB6含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V反总÷V样

                  = 13.76×（△A - 0.0205）

V反总：反应总体积，0.2mL；：V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b．用96孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.1818x+0.0205，R2 = 0.9986

1. 按照蛋白含量计算

VB6含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反总÷（V样×Cpr）

                    = 27.52×（△A - 0.0205）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

VB6含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818 ×V反总÷（V样×W÷V样总）

                = 27.52×（△A - 0.0205）÷ W

3. 按照细胞数量计算

VB6含量（μg/104 cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反总÷（V样×细胞数量÷V样总）

                     = 27.52×（△A - 0.0205）÷ 细胞数量

4. 按照液体体积计算

VB6含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V反总÷V样

                  =27.52×（△A - 0.0205）

V反总：反应总体积，0.2mL；：V样：加入样本体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

1. 若测定结果中吸光值超过1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2. 蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，在计算公式中乘以稀释倍数。

3. 显色完成后立即进行测定。

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