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货号 | 产品名称 | 规格 |
AS6321376 | 丙酮酸羧化酶(PC)测试盒(比色法) | 100管/96样 |
AS6321376 | 丙酮酸羧化酶(PC)测试盒(比色法) | 50管/48样 |
测定意义:
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC,EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中,催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,是糖异生过程的第一个限速酶,在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。
测定原理:
PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+,在340nm下测定NADH氧化速率,即可反映PC活性。
需自备的仪器和用品:
分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体18 mL×1瓶, 4℃保存;
试剂二:液体13uL×1支,4℃保存;
试剂三:粉剂×1支,-20℃保存;
试剂四:粉剂×1支,-20℃保存;
样本的前处理
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL提取液,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
将匀浆600g,4℃离心5min。
弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的PC(此步可选做)。
在步骤④的沉淀中加入1mL提取液,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体PC活性测定。
测定步骤:
分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用;置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四的配制:在试剂四瓶中加入1mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂四和180μL工作液,立即混匀,记录340nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:在该试剂盒中,若ΔA大于0.5,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使ΔA小于0.5可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
PC活性计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1608×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=3.215×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3216×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PC(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=6.43×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
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