抗体（antibody，Ab）是机体在体内存在的外来分子、微生物等抗原物质刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig），主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。抗体特异性鉴定是免疫化学技术中，确保抗原-抗体反应专一性的基础。从根本上验证特异性，投稿国际期刊，常常需要准备这方面数据。

     鉴定抗体的特异性有四种基本方法：分子遗传法、独立抗体验证法、正交法和标签蛋白法。四种方法并非必须同时采用。通常，根据实验的目的和研究设计的特点，选择对自己的实验来说具有说服力的1到2种即可。

1、分子遗传法。

对于遗传编码清楚的蛋白质，可采用分子遗传学技术（基因敲除模型、CRISPR-Cas9、RNA干扰等）将该蛋白的表达水平显著降低，然后用待检抗体进行标记。如果得到阳性减弱或消失的结果，说明抗体标记的正是该蛋白质。采用该方法要注意两个问题。其一，针对基因的敲除或敲减操作不一定能马上减少相应的蛋白质水平。有的蛋白质在生物样本中可能有足量储备，存在“缓冲池”；必须耗去这部分存量才能观察到表达的下降。能否在允许的时间内下调蛋白水平，是一个需要预试的问题。其二，基因及相应的蛋白质水平下调后，抗体标记强度减弱，其实验证了抗体和该基因产物的“相关性”，但严格说来，还有可能标记的并不是目标蛋白质。尚存在这样的可能：抗体标记的蛋白质是与目标蛋白有密切相互作用的另一种蛋白。比如，目标蛋白减少后，抗体实际标记的蛋白无从锚定（比如膜蛋白），进而在标本处理过程中流失，结果免疫标记强度减弱。此时应设计针对性的实验来补充验证。

2、独立抗体验证法。

同一目标分子，可采用针对不同抗原决定簇的抗体来标记。当需要对某种蛋白分子进行免疫标记时，如果手中已有经过特异性鉴定合格的其他抗体，且识别的结构位点与待检抗体不同，那么原有抗体就可作为一个良好的阳性参照。如果待检抗体与原有的合格抗体具有相同的标记结果，说明待检抗体的特异性是合格的。本法应用时须注意蛋白分子亚型之间的区别。比如，待检抗体与原有合格抗体的识别位点在有的亚型二者都存在，而有的亚型则可能缺少其中之一。结构变化可能引起功能和分布的差别，此时本法就不能起到鉴定作用。

3、正交法。

正交法即采用互不影响的技术对抗体标记的是否为目标分子进行鉴定的方法。比如要鉴定抗体是否能特异性标记某蛋白质，可通过质谱技术、色谱分离技术、针对生成该蛋白的RNA的原位杂交等，与抗体标记一道进行平行实验。如果不同技术的检测丰度/强度一致，说明抗体的标记具有特异性。采用该法时须注意各种技术自身的非特异性问题，避免因参照技术本身的特异性缺陷而减弱鉴定结果的说服力。

4、标签蛋白法。

可采用FLAG、V5等亲和标签或GFP等荧光偶联蛋白对待检抗体进行鉴定。如果抗亲和标签的抗体标记强度或荧光信号强度与待检抗体的标记强度一致，则说明待检抗体具有特异性。

特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。

1、蛋白特异性

针对需要检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分：

a.重组蛋白如果不是全长表达，则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。

b.内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式，特殊表型的蛋白需要进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，查看交叉反应的情况。

c.磷酸化蛋白检测需要确定具体位点，不同位点的磷酸化意味着可能有不同的机制存在，不宜一概而论。

2、种属特异性

同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。

a.目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或设计多肽抗原的，根据蛋白的同源性的情况与其他种属发生交叉反应。需要参照说明书注明的可反应种属信息。

b.一些稀有种属很难找到抗体，可以通过蛋白的序列比对，选择同源序列免疫的抗体，不过一般这种情况生产商不会受理其关于质量的申诉，如果可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体选择。

3、实验方法特异性

目前使用抗体的实验方法有很多，不同的使用方法过程中，因为对蛋白样品的处理方式不一样，蛋白的含量有差异，对抗体的识别表位和效价要求都是不一样的。

4、标记物的特异性

一般基于实验操作的实验方法不会使用带有标记的一抗，比如 WB、IHC 等，都是通过二抗类的试剂标记达到结果呈现的目的。但是基于仪器分析的一些实验，可能就会使用到直接标记的一抗，比如流式实验。那么需要了解到自己将要使用的仪器能检测到的荧光范围，针对不通的参数要求选择对应的标记物。在免疫荧光双标实验中，需要选配不同的荧光标记物。