非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒（恒温荧光法）使用说明书

【产品说明】

本产品基于的恒温荧光检测技术，可针对抗凝血、脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏和骨髓等样品中非洲猪瘟病毒的的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。

本产品用于非洲猪瘟病毒的检测，检出限为10² copies/μl。

【货 号】 YRMBV7201-2

【包装规格】 50T

【试剂盒组成】

【储存条件及有效期】

-20℃保存，有效期为12个月（请在有效期内使用）。

【适用仪器】

YR-820 恒温扩增荧光检测仪。

【样品采集及存放】

待测样品为 -20℃保存样本或新鲜待检样本

【样品处理】

可采集发病动物或同群动物的血清学样品和病原学样品，病原学样品主要包括抗凝血、脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏和骨髓等。如环境中存在钝缘软蜱，也应一并采集。

样品的包装和运输应符合《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范》规定。规范填写采样登记表，采集的样品应在冷藏和密封状态下运输到相关实验室。

一、血清学样品：无菌采集5ml血液样品，室温放置12～24h，收集血清，冷藏运输。到达检测实验室后，冷冻保存。

二、病原学样品

1．抗凝血样品：无菌采集5ml抗凝血，冷藏运输。到达检测实验室后，－70℃冷冻保存。

2．组织样品

2.1 脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等，冷藏运输。

2.2 样品到达检测实验室后，－70℃保存。

3．钝缘软蜱

3.1 将收集的钝缘软蜱放入有螺旋盖的样品瓶/管中，放入少量土壤，盖内衬以纱布，常温保存运输。

3.2 到达检测实验室后，－70℃冷冻保存或置于液氮中；如仅对样品进行形态学观察时，可以放入99%酒精中保存。

【检测步骤】

自备材料和仪器：①灭菌1.5mL或2.0mL离心管；②灭菌0.2mL PCR管或八联管；③冰盒；④移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；⑤离心机；⑥涡旋混匀器；⑦金属浴

一、DNA提取（样本制备区）

建议使用病毒基因组DNA提取试剂盒系列产品，具体过程详见说明书。

二、试剂配制（试剂准备区，放置于冰盒中进行）

若有N个待检样品，则参照下表，按照N+2个数量计算各组分用量（N个待检样品+1个阴性对照NG+1个阳性对照PG），将反应液置于0.6ml或者1.5ml离心管中，涡旋混匀，离心30秒，分装于0.2ml PCR管中，并向每管加入1滴C-I（约20μl）。

三、添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）

向PCR管中分别加入2μl模板，顺序为阴性对照（阴性对照管可不加入模板）、待测样品模板、PG-ASFV-I，离心30秒，立即进行扩增反应。

四、扩增反应（扩增及产物分析区）

(一)、恒温仪器63℃条件下反应30 min。待仪器升温至63℃后，新建程序，设置实验名称及反应时间，将步骤三中离心后的PCR反应管放入恒温扩增荧光检测仪，点击开始检测。

(二)、若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃ 15 s，63℃ 45 s作为一个循环，于63℃ 45 s处收集荧光信号，30个循环。

其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

【结果判定】

1、 仪器自动判定结果，若显示“阳性”，则样品中含有非洲猪瘟病毒；

若显示“阴性”，则样品中不含有非洲猪瘟病毒或含量低于检测限。

2、 在检测仪上，根据有无“S”型扩增曲线判定结果。

若有“S”型扩增曲线，则样品中含有非洲猪瘟病毒；

若无“S”型扩增曲线，则样品中不含有非洲猪瘟病毒或含量低于检测限。

« 阴性对照反应管结果显示“阴性”，阳性对照反应管结果显示“阳性”，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。

【注意事项】

1、本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

1）一区：试剂准备区；2）第二区：样本制备区；第三区：模板添加区；第四区：扩增及产物分析区。

★ 分区之间*进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2、实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3、严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4、反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

5、反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6、不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

原创作者：厦门科朋仪器有限公司