填料吸附色素的来源与去除的方法优化
时间：2024-04-26 阅读：2497
吸附色素对填料的影响：
色素沉积在层析柱中，
不仅对其分辨率，收率有影响，
更严重影响其使用寿命。
色素污染层析填料的具体表现
色素污染层析填料的具体表现是含有色素的中间体在层析系统上样过程中，色素会首先与层析柱上层填料结合，导致层析填料由乳白色变成色素相应的颜色，随着上样量和填料循环数的增加，色素会逐步扩散到中下层填料，严重时色素等杂质带来的污染能让层析柱内的填料塌陷。
过度积累的色素将导致填料的使用寿命降低，具体表现是填料载量明显下降，填料外观颜色变深。通常情况下，这些填料吸附的色素会被后续再生工序中的再生液去除，从而恢复填料性能，也避免吸附在填料上的杂质污染下一个工艺循环，将蛋白质原液的杂质残留降至最低，从而减淡蛋白质中间体的颜色，实现更好的原液质量。
填料吸附色素的来源
填料吸附的色素主要来源于蛋白，而影响蛋白溶液外观、且难以去除的色素主要是由培养基组分在培养和收获过程中与蛋白分子相互作用形成的。
据文献报道，色素广泛存在于蛋白质中间体和最终原液中，具体表现为蛋白质中间体和原液呈现不同的颜色，尤其在高浓度蛋白质溶液中尤为显著，比如哺乳动物细胞培养基中的维生素B12转化为羟氧-B12之后与抗体分子结合导致粉色，铁离子等的高氧化性使其在氧化应激下产生高活性氧 (ROS) ，使抗体分子表面色氨酸残基氧化导致黄色或黄褐色；毕赤酵母诱导中后期，AOX1醇氧化酶释放进入发酵液，结合黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 辅因子形成八聚物导致绿色。另外，天然互作蛋白以及小分子色素等，也可能会引入颜色。
填料色素的去除方法
色素是一类物质，不同来源的色素的清洗过程差异较大，可根据介质的性质及色素的性质进行清洗，碱洗，酸洗，有机溶剂，变性剂都可以尝试。根据色素的不同性质，也可以尝试不同的去污剂，注意避免操作中产生气泡。 如果去除不掉，可以定期把色素污染部分的填料去除，或验证是否对于样品纯化造成影响。
色素的去除方法：
• 铁离子残留带来的黄褐色去除：
0.1M HCl+2M NaCl；0.5M磷酸。
• 维生素B12引起的粉色去除：
1M醋酸+4%半胱氨酸；0.3M组氨酸+0.5M NaCl。
• 疏水作用力结合的色素去除：
0.5-1M NaOH。
• 脂类色素：
0.5M 非离子去污剂；70%乙醇；30%异丙醇。
• 沉积的顽固色素：
1M醋酸；1M NaOH+2M NaCl；6M盐酸胍；8M尿素。
色素清洗过程注意事项：
• 清洗过程要综合考虑污染物的类型及介质的种类，清洗的同时要减少对介质的损伤。
• 清洗使用氢氧化钠或者其它极端条件对填料的寿命性能都有很大影响，清洗时极端条件接触时间控制在30分钟以内，CIP时控制在3CV以内。
• 清洗时除了单一的清洗方式，也可以考虑使用混合试剂进行处理，清洗过程并非是固定不变的。
• 清洗试剂应选择纯度高的试剂，避免二次污染。
• 清洗之后要立即放到中性保存。
• 清洗状态的确定及方法的确定要结合整个工艺过程。
• 清洗之后要对清洗过程进行验证，保证清洗目的实现，可通过测定载量，流速等介质的性能指标验证。
填料色素去除案例展示
使用1M醋酸+4%半胱氨酸对CIP清洁后呈现粉色色素残留的MaXtar ARPA填料进行再生清洗，清洁后外观显示可彻底清楚色素残留。
对清洁后层析柱再生溶液进行了收集并送检VB12含量测定，检测报告同样显示无VB12。再生清洗前后对比
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左：清洗前；右：清洗后
百林科VB12含量检测报告：
参考文献：
[1]翁志兵,王鹏红,赵力,等.层析填料中顽固色素去除的新方法研究[J].食品与生物技术学报, 2022(002):041.
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