GLP-1及类似物工艺特点
时间:2024-03-15 阅读:1866
GLP-1(胰高血糖素样肽-1)
是一种在调节血糖水平中
起重要作用的激素
是一种在调节血糖水平中
起重要作用的激素
近年来,GLP-1及其类似物在糖尿病治疗中受到了广泛关注。由于其可刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌,所以成为了美国 DM 协会和中华医学会 DM 学分会推荐的强效降糖药物[1-2]。
GLP-1类似物包括艾塞那肽 (exenatide)、 利 西 那 肽 (lixisenatide)、 利 拉 鲁肽 (liraglutide)、杜拉鲁肽 (dulaglutide)、索玛鲁肽(sermaglutide) 及阿比鲁肽 (albiglutide) 等 [3],已上市GLP-1类药物主要包括贝那鲁肽、艾塞那肽、利拉鲁肽、利西那肽、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包载的长效艾塞那肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽、索马鲁肽、聚乙二醇洛赛那肽注射液和口服索马鲁肽[4]。
然而,GLP-1及其类似药的生物活性易受其低纯度的影响,且根据不同肽的开发策略和生产特性(图1)图,需要采用不同的纯化路线,目前在研的GLP-1类似药主流工艺如下:
1、改造GLP-1本身结构
2、连接抗体Fc片段的GLP-1类似药
3、连接HSA片段的GLP-1类似药
4、未偶联复杂配基或侧链的GLP-1类似药
5、连接PEG、脂肪酸侧链的GLP-1类似药
因此,开发有效的纯化方法对于提高其生物活性和临床应用至关重要。
图1 GLP-1类似物的开发策略[5]
图2 利拉鲁肽分子结构示意图
图3 司美格鲁肽分子结构示
纯化工艺简介
GLP-1及其类似物上游制备工艺主要分为两大类:生物发酵法(如:利拉鲁肽、司美格鲁肽)与化学合成法(如:替尔泊肽、艾本那肽)。
化学合成法:
艾本那肽制备为例,以氨基树脂为原料,先将树脂脱Fmoc保护,再用逐一缩合的方式依次连接带有保护基的氨基酸,直至完成树脂肽直链合成;然后脱除Lys( Mtt )的侧链Mtt保护基,再用逐一缩合的方式依次连接侧链连接剂,得到艾本那肽前体树脂肽。再通过裂解、纯化得到艾本那肽前体及其类似物[6]。
优势:
可插入非天然AA(如含非天然氨基酸的索马鲁肽和聚乙二醇洛赛那肽一般采用固相合成法);下游纯化简单,可沉淀离心得到粗肽。粗肽经过反相填料循环纯化来获取精肽[7]。
劣势:
合成肽段一般不超过50个AA
生物发酵法:
大肠杆菌/酵母和CHO细胞比较常见,有多肽与白蛋白或者Fc等其他标签融合表达。针对融合蛋白表达的GLP-1RA多肽的纯化和酶切工艺,要经过膜过滤、镍亲和层析、反相纯化等处理,获得高纯度肽-融合蛋白,之后对其进行酶切、纯化,即可获得多肽主链,也有利用通过构建载体、转染等步骤构建工程菌,培养并诱导工程菌融合蛋白包涵体表达,之后通过变性溶解、复性、酶切、亲和流穿和离子交换纯化等步骤,最终获得GLP‑1及其类似物[10-12]。
优势:
同时安全性高、成本低、生产规模大,适合长肽段的发酵。
劣势:
下游纯化路线较长。
就目前来看,生物发酵法的成本相对较低。不同的上游制备工艺也会对下游层析工艺提出不同的需求。
表1 不同生物发酵法的填料选择
1、酵母/大肠表达GLP-1的纯化工艺:
第一步和第二步阴阳离子层析可以去除大量HCP和HCD,收获相对比较纯的粗肽,第三步反相层析则可进一步去除降解肽和异构肽。
2、大肠杆菌表达His标签GLP-1类似物的纯化工艺
大肠表达通常为包涵体,溶解包涵体会加入高浓度尿素或盐酸胍和还原剂,推荐使用TED螯合的Ni Chromstar® Excel. 其他亲和填料如Glutathione Chromstar® 4FF可以适用于GST标签蛋白的纯化。
3、CHO表达融合蛋白GLP-1类似物(GLP-1-Fc)纯化工艺
CHO表达GLP-1类似物为FC融合蛋白,可参考抗体类蛋白进行纯化。若为HSA融合,则可以采用Blue Chromstar® FF替换上图的第一步层析。
图5 GLP-1-Fc 融合蛋白ProteinA亲和纯化图谱[7]
图6 GLP-1融合白蛋白蓝胶亲和纯化谱图[8]
参考文献:
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[2] 中华医学会糖尿病学分会. 中国2型糖尿病防治指南(2020年版)[J]. 中华糖尿病杂志, 2021, 13(4): 315-409.
[3] Drucker DJ. GLP-1 physiology informs the pharmacotherapy of obesity. Mol Metab, 2022(57):101351.
[4] LOVSHIN J A. Glucagon-like peptide-1 receptor agonists:a class update for treating type 2 diabetes[J]. Canadian Journal of Diabetes, 2017, 41(5): 524-535.
[5] JIANG Jing-qing, FU Ling, TAN Meng-lu, CHEN Sheng-fu. Studies on glucagon like peptide-1 (GLP-1) analogues: a review. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 2020, 34(6): 1327-1338. DOI: 10.3969/j.issn.1003-9015.2020.06.001.
[6] 魏振兴,孟天行,胡丽英,等.一种艾本那肽前体的制备方法:
CN201910413558.5[P].CN110183531A[2024-03-07].
[7] 黄嘉成,张宝乐,尹传龙,等.
一种GLP-1类似物的纯化方法及其应用:
CN202111628133.X[P].CN202111628133.X[2024-03-07].
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融合蛋白(GLP-1_(A2G))_2-HSA的分离纯化及其活性评价[J].药物生物技术,2010,17(06):487-492.DOI:10.19526/j.cnki.1005-8915.2010.06.004.
[10] 王伟明,耿月兵,胡明明,等.
一种脂肪酸酰化胰岛素和GLP-1多肽的纯化方法:CN202010527826.9[P].CN111518193A[2024-03-07].
[11] 殷世清,张甲庆,朱永真,等.
一种利拉鲁肽融合蛋白在位酶切和纯化的方法:CN202210308152.2[P].CN114790473A[2024-03-07].
[12] 梁涛,高婷,李进军,等.重组Arg^(34)-GLP-1[7-37]杂质的分离纯化及质谱解析[J].中国新药杂志, 2021, 30(6):562-568.
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