百林科多样层析填料，助力IgM纯化
时间：2024-02-01 阅读：1901
IgM纯化并非易事
IgM 抗体是免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)的一种类型，主要存在于体液免疫应答的早期阶段。纵观免疫球蛋白的进化史，IgM是最古老的抗体类型之一。在宿主抵御病原入侵的免疫响应过程中，每种类型的抗体都有其独特的功能效应。IgM最初表达于B淋巴细胞表面，参与构成B细胞表面受体 (BCR) 。B细胞活化后，可由浆细胞产生分泌型IgM (sIgM) ，参与早期体液免疫应答。相较于其他类型的免疫球蛋白，IgM具有分子量大、抗原结合位点多、亲和力高等特点，使其在抗感染免疫中发挥重要作用。然而，在实际应用中，由于IgM与其他免疫球蛋白存在交叉反应，导致其纯化困难。
纯化前，你需要知道的事：IgM的特点
01 分子量大
IgM的单体大小在190 kDa左右，重链由一个可变区 (Vμ) 和四个恒定区 (Cμ1-4) 组成，轻链由一个可变区和一个恒定区组成 (Vκ‐Cκ/Vλ‐Cλ) ，在重链的C端还有一条18个氨基酸短肽对于IgM的多聚化至关重要，且将该序列整合至其他类型的抗体分子也能促使其产生多聚体。IgM通常以五聚体 (pentamer) 或六聚体 (hexamer) 的形式存在，两者的分子量分别在900 kDa与1,050 kDa左右，其中五聚体是一个非正五边形结构，内含一个50°左右的缺口由J链 (J-chain) 占据以保持构象稳定，是 IgG、IgA 和 IgE 的 10 倍左右。
02 抗原结合位点多
每个 IgM 分子有 10 个抗原结合位点，使其具有较高的亲和力和识别能力，是最有效的抗体。相比于IgG，多聚体结构使IgM能够多价结合抗原并且更加高效稳定地结合补体C1q(图2)，启动补体依赖的细胞毒效应 (CDC) 。同时，五聚体IgM中的J链还能够与上皮细胞表面的多聚免疫球蛋白受体 (pIgR) 结合，进而将IgM转运至黏膜表面参与黏膜免疫。
03 亲和力高
由于 IgM 抗体结合抗原的位点较多，使得其与抗原的结合力相对较高。早期的IgM项目几乎使用的都是未经历抗体亲和力成熟天然抗体，具有较低的亲和力与特异性，因此效果大多不尽人意，但这些临床试验至少证明了IgM的安全性。通过对IgM的工程化改造，例如在J链处引入CD3抗体或其他配体分子使其发挥细胞桥接作用，能够使IgM的临床价值进一步提升。
如何获得高纯度IgM抗体?
无论是应用于病原感染的早期诊断还是疾病治疗，如何有效获得高纯度IgM抗体是我们必须要解决的问题。相较于IgG，IgM的分子量更大、溶解度更低且更易降解，盐浓度、pH、温度都会在很大程度上影响IgM的稳定性。因此在遵循CIPP纯化策略的基础上，对IgM的纯化需要有更多考量。 百林科拥有多样的层析填料，可满足于不同情况的纯化要求。
方法一、亲和层析法
IgM的Fc段存在较大的空间位阻，因此通常认为Protein A难以用于IgM的亲和捕获，但这并非是绝对的。Protein A除了能够结合抗体Fc段，还可与VH3基因参与编码的重链可变区序列结合实现对抗体的捕获。因此，对于IgM的纯化，以百林科 MaXtar® ARPA为代表的高载量、高耐碱Protein A抗体亲和填料仍然是个值得尝试的选择。
在Protein A效果不理想的情况下，可以着眼于Fab段的其他结构域进行亲和填料的选择。其中MaXtar® Protein L具有广谱的抗体结合活性，同样可应用于天然或重组IgM的纯化。
考虑到IgM的稳定性，Protein A/L低pH的洗脱条件对于部分IgM可能有些剧烈，这种情况下可以选择其它类型的亲和介质。由于IgM具有大量的二硫键，基于嗜硫亲和原理的百林科MaXtar® PlasmidCap HR 亲和填料也非常适用于IgM的纯化。
除成品的亲和填料外，还通过制备特定的抗原或抗体，将其固定在预活化填料上，利用IgM抗体与其他免疫球蛋白的特异性结合，实现 IgM抗体的纯化。这种方法具有较高的特异性，但操作过程较为复杂，需要制备特定的层析柱。
➤ 百林科 MaXtar® ARPA 抗体亲和填料是一款用于抗体纯化的亲和层析介质，通过抗原与抗体之间特异性相互作用进行分离。MaXtar® ARPA 拥有高载量、高流速、耐碱的特性：(1) 高流速、高动态结合载量缩短了处理时间。(2) 修饰的耐碱 rProtein A 配基可耐受 0.5M NaOH 进行 CIP。
层析填料全家福
方法二、 凝胶过滤法(含复合多模式)
鉴于IgM具有分子量大的特点，可以利用IgM与其他蛋白质在分子大小上的差异，通过百林科Chromstar® 6FF 凝胶过滤填料将IgM从混合物中分离出来，这种方法操作简便，但特异性较低，容易受到大分子杂质的干扰。且传统的凝胶过滤由于上样量小、流速低、层析过程比较耗时等原因不利于维持IgM的稳定。因此，同样基于尺寸排阻原理开发的百林科 MaXtar® COLL 多模式填料系列同样适用于将IgM从混合物中分离出来。
区别于传统的层析介质，百林科 MaXtar® COLL 多模式填料由两层不同的结构组成：外壳是多孔的钝化层 ，确保 400/700KD 以上的大分子不会进孔，直接走外水流穿；核心是偶联了同时具有疏水和吸附负电荷作用基团的球形内核，最大程度结合宿主蛋白、核酸等杂质。该层析介质能很好的用于多种大分子生物祥本的分离纯化。经清洁再生后，填料可重复使用。相较于传统的凝胶过滤，采用流穿模式的MaXtar® COLL 700和MaXtar® COLL 400都能够支持更大的上样体积和更高的流速，综合效率提升了100倍，更加适合IgM的纯化。
➤百林科Chromstar® 6FF 凝胶过滤填料 是一款高度交联 (交联比为6%) 琼脂糖基架的凝胶过滤层析介质，利用不同分子的分子量差异和分子构象不同对其进行分离。该层析介质能很好的用于多种生物分子的分离纯化，比如：重组蛋白、抗体、核酸、病毒及类病毒颗粒、多糖等类型项目。
表：Chromstar® 6FF产品参数
➤ 百林科MaXtar® COLL 多模式填料是一款多模式层析介质。区别于传统的层析介质，它由两层不同的结构组成：外壳是多孔的钝化层 ，确保 400/700KD 以上的大分子不会进孔，直接走外水流穿；核心是偶联了同时具有疏水和吸附负电荷作用基团的球形内核，最大程度结合宿主蛋白、核酸等杂质。该层析介质能很好的用于多种大分子生物样本的分离纯化。
方法三、离子交换层析法
离子交换层析法是利用IgM与其他蛋白质在离子强度和pH值上的差异，通过离子交换树脂将 IgM 从混合物中分离出来。这种方法操作简便，能够有效去除样品中的HCP、HCD、内毒素以及病毒。IgM的等电点分布范围大致在5.5-7.4之间，根据不同IgM分子的实际等电点，可灵活采用流穿模式或结合洗脱模式。
➤百林科MaXtar® Q HR 是一款高分辨率的强阴离子交换层析介质，利用不同分子在特定条件下电荷性质和多少的差异对其进行分离。该层析介质能很好的用于多种生物分子的分离纯化，比如：重组蛋白、抗体、核酸、 病毒及类病毒颗粒、多糖等。
➤百林科MaXtar® DEAE 是一款弱阴离子交换层析介质，利用不同分子在特定条件下电荷性质和多少的差异对其进行分离。该层析介质能很好的用于多种生物分子的分离纯化。相比于传统的弱阴离子交换层析介质，MaXtar®DEAE 表现出更优的性能：(1) 改良的MaXtar® 基架具有更强刚性，因此在较低的反压下能够实现更高工艺流速，提高工艺效率。(2) 通过升级配基偶联方式，提高层析介质的动态结合载量
➤百林科MaXtar® MMA HR 是一款改良琼脂糖基架的多模式层析介质。区别于传统的离子交换层析介质，它由多个不同性质的基团组成：氨基、氢键和疏水基团。该层析介质可以去除核酸、宿主蛋白、聚集体、病毒 等主要杂质，广泛应用于多糖、抗体、病毒载体或疫苗领域。相比于传统的单一模式层析介质，MaXtar® MMA HR 表现出更优的性能 : ⑴ 高动态载量，一步结合大部分杂质，节约时间和成本。⑵ 改良的 MaXtar®基架具有更强刚性，因此在较低的反压下能够实现更高工艺流速，提高工艺效率。⑶ 细粒径设计，分辨率高。⑷ 耐受广泛的 pH 和电导率范围，有助于摸索最优工 艺条件。
方法四、羟基磷灰石
BaronCHT®，羟基磷灰石 [Ca10(PO4)6(OH)2 ] 是一种无机纯相层析介质，高温焙烧成球体，其晶体结构与骨羟基磷灰石相同，且球体结构稳定，粒径均匀。羟基磷灰石与生物分子之间具有多种模式的相互作用，可同时实现阳离子交换和钙金属亲和两种分离机制。阳离子交换主要依赖于羟基磷灰石上带负电荷的磷酸基，同时，生物分子上的羧基簇合物、磷基簇合物等都能通过金属亲和作用与羟基磷灰石上的钙形成更强的结合。由于这些独特的分离机制，使得羟基磷灰石广泛应用于抗体、 疫苗 ( 细菌多糖、肺炎多糖、病毒等 )、核酸、酶和重组蛋白等领域。其中BaronCHT® TypeⅡ在IgM上的纯化应用也普遍有着良好的纯化效果。
IgM的纯化案例
阴离子Q+羟基磷灰石二型两步法纯化
SEC结果结果可见两步法纯化后IgM纯度可达99%
总结
纯化 IgM 抗体是研究 IgM 抗体结构和功能的重要前提。纯化 IgM 的方法有多种，各种方法都有其优缺点，在选择纯化方法时，需要根据实际情况和需求进行综合考虑。对此，百林科在凝胶过滤法、离子交换层析法和亲和层析法等几种常用的IgM纯化方法均拥有丰富的适用产品可供选择进行使用！
表：IgM纯化选择汇总
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