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工艺开发及优化：下游蛋白质纯化技术的实践与方案

时间：2024-01-26 阅读：1404

　　蛋白质纯化技术，是生物下游技术中非常重要的组成部分，掌握蛋白质纯化技术的基本理论与操作，对相关专业学生的继续深造以及就业发展均有重要作用【1】。重组蛋白的表达(尤其是使用细菌载体和宿主)是一项成熟的技术。难点在于如何将其以活化形式分离。

　　利用基因工程技术生产重组蛋白一般可以分为上游、中游和下游三个部分。上游技术指包括基因重组与克隆，工程菌的构建与表达等在内的重组DNA技术，中游技术主要指工程菌或细胞的发酵技术，而下游技术则是指重组蛋白的分离纯化技术【2】。

　　蛋白质在细胞中一般以复杂的混合物形式存在，且不同的蛋白质物理化学性质差异很大。

　　因此，到目前为止，还没有一个完全固定的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离纯化出来【2】。不同的重组蛋白具有不同的氨基酸序列和空间结构，导致其物理、化学和生物学特性存在差异。我们也可以根据目标蛋白与其他蛋白和裂解液的性质差异设计合理的蛋白纯化方案。

　　一般来说蛋白质的纯化可以分为3个连续的阶段：捕获，中度纯化和精细纯化(如下图所示)。当然在纯化步骤之前通常还需要提取、澄清和浓缩最初的细胞裂解物【2】。

图1

　　重组蛋白的纯化是生物学研究中的重要技术。为了研究蛋白的特定功能和结构，研究人员必须将重组蛋白从生物体中分离并纯化。蛋白纯化方法主要利用不同重组蛋白之间的相似性和差异性。可以根据蛋白之间的相似性去除非蛋白物质，然后根据蛋白之间的差异分离纯化目标重组蛋白。

　　由于组成蛋白质的氨基酸种类、数目、序列以及折叠形式各不相同，因此表达的重组蛋白物理和化学性质差异很大，而重组蛋白的分离纯化就是利用这种性质上的差异，从而将目标蛋白从细胞或培养液中分离纯化出来。蛋白质纯化过程中常用的蛋白性质包括：大小、形状、荷电性、等电点、疏水性、溶解度、密度、与配体结合能力、与金属鳌合能力以及某些特殊性质(如耐热性、抗蛋白酶)等。以这些性质为基础，人们己经开发了多种用于蛋白质分离纯化的方法。具体见表所示【2】。

图2

　　层析技术又称色谱，是目前使用广泛的，同时也是可靠的蛋白质分离纯化方法。其是基于样品在固定相与流动相中的分配差异，从而实现目标蛋白分离纯化的方法，具有分离效率高、适用性广、易于放大等优点。常用的层析技术主要包括五大类：凝胶过滤层析、疏水作用层析、离子交换层析、亲和层析以及反相层析，各层析技术原理如图所示。近年来随着技术的进步，人们又在传统层析技术的基础上，开发了兼有多种模式的混合模式层析技术以弥补传统层析技术在某些方面的不足，其中，疏水电荷诱导层析是具代表性的新型混合模式层析技术，具有广泛的应用价值【2】。

图3 常用层析技术的分离原理【3】

　　纯化技术的选择与组合是对蛋白质进行成功纯化的关键，其最终目的就是经过合理设计与优化，能使获得高收率、高纯度以及低成本的目标蛋白纯化工艺。近年来，虽然有学者报道通过采用计算机为基础的专家系统来预测和优化纯化工艺，但由于蛋白质的复杂性，该方法还很难用于实际蛋白质的分离纯化过程。因此，目前人们在制定纯化方案时往往还是单纯根据经验或实验来选择与组合纯化技术。

　　重组表达系统下游工艺方案

　　原核表达体系