本研究中，笔者测试了作为一种全新技术的Sartoclear Dynamics® Lab V500，用于在Sf9细胞表达重组蛋白纯化前，对细胞培养液进行快速澄清的效果。蛋白表达载体带有一段信号编码序列，从而确保表达后的蛋白能够分泌到细胞外。因此，纯化蛋白质之前必须去除培养基中的细胞，但是使用传统方法操作（过滤后进行离心操作）十分费时。本文中，笔者通过与传统方法进行对比，展示了Sartoclear Dynamics® Lab 过滤器的强大性能。它不仅不会影响蛋白产量，还能节省大量时间；对于任何致力于提高昆虫细胞表达系统生产率和通量的实验室来说，它必将是之选。
引言
了解蛋白质的三维结构是理解其功能的关键。对于疾病中所涉及的蛋白质，三维结构信息将有助于设计出针对靶向目标的、具有高度特异性的新型药物。
纯化蛋白对于测定结构十分重要。如今，使用不同的蛋白表达系统已经成为众多实验室的惯例做法。表达系统的选择通常取决于物种、蛋白的修饰程度和目标蛋白质的产量。在表达载体中使用信号序列，可在细胞培养基中分泌出纯度相对较高的表达蛋白质，且无需使用昂贵的细胞破碎设备，还能够很大程度地缩短优化纯化方法[1]所需的时间。然而，该方法存在重大缺点，即在纯化之前需要耗费大量时间才能澄清大量的细胞培养液。此外，所使用的离心机处理量有限，这还会增加澄清培养基所需的时间，因为它必须多次运行才能达到我们的需要。笔者还注意到，在过滤昆虫细胞培养基时，即使已经通过离心去除了细胞，流速仍旧很慢。这可能与存在亚微米粒子有关，在哺乳动物细胞培养液离心操作后，它仍悬浮于其中，从而导致堵塞过滤膜[2]。
当初开发Sartoclear Dynamics®系列过滤产品是为了大大减少从培养液中过滤哺乳动物细胞所需的时间。通过向培养液中添加硅藻土，可促进多孔滤饼成型，进而防止过滤器堵塞，并快速获得样品中的细胞培养上清液（图1）。由于无需离心操作步骤，因此可避免由于离心容量和可用性所导致的问题。对于笔者的研究而言，昆虫细胞能够表达并分泌目标蛋白，必须对培养上清液进行纯化。因此，笔者测试了Sartoclear Dynamics®用于澄清昆虫细胞（包含目标蛋白）培养上清液的效果，并将结果与标准方法进行了对比。
图1：使用传统方法和Sartoclear Dynamics® Lab 主体加料过滤方法澄清细胞培养液的原理
材料和方法
采用昆虫杆状病毒表达系统来表达目标蛋白。根据制造商的说明，在Sf-900™ II SFM (Thermo Fisher Scientific, 10902088) 中培养 Sf9 细胞 (Thermo Fisher Scientific, 11496015 ) 。使用带有目标蛋白编码基因的杆状病毒感染1.5L的悬浮培养液，并在27°C温度下以240 rpm的转速震荡孵化90个小时。
收获培养液并分成三个470 mL等量样本，用于澄清和蛋白质纯化。份等量样本使用标准方法进行澄清。将细胞5,000g离心15分钟后，将上层清液通过 0.22 μm的PES过滤器。然后，使用Sartoclear Dynamics®系统澄清第二和第三份样本。添加5或10g硅藻土，并将溶液混合成均匀的悬浮液，然后使用0.22μm的PES过滤器对培养液进行过滤。
使用金属鳌合亲和层析（IMAC）方法纯化细胞培养基中每个澄清样本的蛋白质。将培养基串联加载至 5 × 1 mL HisTrap层析柱中（通用生命科学部，17-3712-05），并使用HTE缓冲液（50mm HEPES、500mm NaCL、pH 7.4）进行预平衡。使用100 mL HTE缓冲液和75 mL（包含25mm咪唑）的HTE缓冲液清洗层析柱，以去除杂质，并使用25 mL（包含500mm咪唑）的HTE缓冲液洗脱目标蛋白。
结果与讨论
通过收获细胞培养液发现：每毫升总细胞密度的测量值达1.5 × 106。
记录澄清每种细胞培养液样品所花的时间（图2）。将记录时间分为制备时间（即测量培养液容量和平衡离心管或添加分别用于标准方法或Sartoclear Dynamics® 方法的硅藻土）、离心时间（于标准方法）和过滤时间（两种方法）。
图2：根据处理时间比较澄清方法。Sartoclear Dynamics® Lab 大大降低了澄清细胞培养基所需的时间。
使用标准离心过滤方法制备澄清细胞培养基，大约需要34分钟。尽管相对于标准方法，使用含5g硅藻土过滤优化的Sartoclear Dynamics® 并未减少过滤时间，但是略去离心步骤意味着至少可减少53%的总制备时间。将硅藻土数量增加至10g，总制备时间可减少6分钟，至少可节省 82 %的时间。
就通量而言，标准方法及使用5g和10g硅藻土过滤优化的方法的过滤时间分别等同于2.35、2.35 和 14.1 L/h的流速。使用5g硅藻土制备样品过程中，过滤期间可观察到硅藻土和细胞出现部分沉降现象。可能硅藻土早期沉降导致了流速一定程度上的降低。显然，绝大多数硅藻土/细胞混合物可通过轻轻摇晃过滤装置即可重新悬浮，使流速回到正常水平；但过滤更高细胞密度培养液时，使用10g硅藻土的规格，应该更为合适。
为了测试Sartoclear Dynamics®对蛋白产量的影响，应采用IMAC方法纯化每个样品中的蛋白质，并比较洗脱峰的大小（图3）。与使用标准方法制备样品所出现的洗脱峰相比，利用含10g硅藻土过滤优化的Sartoclear Dynamics®系统制备样品可产生具有更高吸光度的洗脱峰，其表明存在更多的蛋白质。但是相比而言，标准方法所产生的洗脱峰较宽（即容量较高），因此使用硅藻土混合样品基本上不会影响蛋白产量。
图3：使用标准离心过滤方法和经10g硅藻土优化的Sartoclear Dynamics® Lab过滤系统制备样品，比较两者之间的蛋白质洗脱峰 (★)。
结论
Sartoclear Dynamics® Lab可加快细胞培养基的澄清过程。使用该过滤系统将无需采取离心操作，节省大量时间，并显著提高生产力和通量。使用硅藻土混合样品后，并未对蛋白质产量产生负面影响。
该系统有多种型号可选，可用于澄清15mL至1L批量的细胞培养基，能够满足用户的众多需求。
留言