近期武汉生物制品研究所与国家联合疫苗工程技术研究中心等团队在《中国生物制品学杂志》发表关于多类型生物反应器培养Vero细胞制备病毒的成果比较，该研究为不同类型生物反应器培养Vero细胞制备病毒，以及放大培养提供了技术支持，为后期更大规模搅拌式生物反应器高密度贴壁细胞培养病毒奠定基础。
目的：
比较搅拌式生物反应器、篮式生物反应器和摇床生物反应器培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)的效果。
方法：
分别采用2L摇床生物反应器(预辐照片状载体袋)、15L篮式生物反应器(片状载体)和40L搅拌式生物反应器(球状载体)培养Vero细胞，制备CV-A10，比较不同类型生物反应器细胞贴壁效率、营养代谢物质含量、细胞生长特性以及病毒滴度和抗原含量差异。
结果：
搅拌式生物反应器仅需适当搅拌即能保证病毒均匀悬浮，以及与球状载体和Vero细胞的充分混匀。搅拌式生物反应器，摇床生物反应器、篮式生物反应器均可用于Vero细胞的稳定培养和CV-A10的高效制备，其中搅拌式生物反应器培养时间短，病毒滴度更高。
01 背景
生物反应器是模拟细胞的体内环境并在体外进行生物培养的系统，其能实现细胞在体外的高密度增长，高效地产出具有医药价值的酶、单抗、疫苗等目标产物。动物细胞无细胞壁，对剪切力非常敏感，为避免细胞损伤，通常需要对生物反应器进行一定改进，如改进搅拌桨、供气方式、加装辅件等，从而优化细胞生长环境。生物反应器培养过程及培养方式具有复杂性，不同类型的生物反应器和生物反应器培养过程参数均会对细胞生长和病毒增殖产生影响。该研究基于Vero细胞和CV-A10，比较摇床生物反应器(预辐照片状载体袋)、篮式生物反应器(片状载体)和搅拌式生物反应器(球状载体)培养Vero细胞和CV-A10的差异性，以期建立Vero细胞和CV-A10高密度、高产量培养方法，为开发包含CV-A10的HFMD多价灭活疫苗提供工艺数据支持。
02 结果
2.1不同类型生物反应器细胞贴壁效率
搅拌式生物反应器接种细胞后0.5、1.5、2.5和3.5 h，上清中游离细胞占比分别为68.33%、57.00%、48.00%和30.00%，接种细胞后3.5 h，上清中有30.00%细胞未贴附至球状载体上面，见图1
图1细胞贴壁效率曲线
2.2不同类型生物反应器营养代谢物质含量
不同类型生物反应器细胞培养过程中，葡萄糖含量变化曲线基本保持一致，均呈先下降后上升趋势。不同类型生物反应器细胞培养过程中，乳酸含量变化曲线基本保持一致，均呈先上升后下降趋势，细胞培养第3～4天时，乳酸含量最高，见图2。
图2葡萄糖（A）和乳酸（B）含量变化曲线
2.3不同类型生物反应器细胞生长特性
Vero细胞在2L摇床生物反应器和40L搅拌式生物反应器的细胞生长曲线均呈S型。
2L摇床生物反应器、15L篮式生物反应器与40L 搅拌式生物反应器病毒收获液抗原含量分别为2 899～5 341、3 932～6 086和3 322～4 262 U/mL。
2L摇床生物反应器、15L篮式生物反应器和40L 搅拌式生物反应器病毒收获液病毒滴度分别为7.750～8.500、7.875～8.250和8.375～9.000 lg CCID50/mL。
搅拌式生物反应器培养时间短，病毒滴度高，这主要是因为搅拌式生物反应器仅需适当搅拌即能保证病毒均匀悬浮，以及与球状载体和Vero细胞的充分混匀。2L摇床生物反应和15L篮式生物反应器由于片状载体传质交换较弱，接种或细胞释放的病毒与片状载体内腔空隙结构生长的Vero细胞的混匀效果较差。此外，相比于球状载体，片状载体由于传质效果更差，载体中残留病毒量可能更多。球状载体培养的细胞更易由于球状载体间的相互碰撞，受感染的细胞更脆弱，病毒能更快地从感染细胞中释放出来。
图3C：40L搅拌式生物反应器细胞形态（× 100）
03 讨论
在搅拌式生物反应器中，球状载体贴壁120min后，贴壁效率能达到约90%。该研究中，搅拌式生物反应器培养时间短，病毒滴度高，搅拌式生物反应器仅需适当搅拌即能保证病毒均匀悬浮，以及与球状载体和Vero细胞的充分混匀。此外，相比于球状载体，片状载体由于传质效果更差，载体中残留病毒量可能更多。球状载体培养的细胞更易由于球状载体间的相互碰撞，受感染的细胞更脆弱，病毒能更快地从感染细胞中释放出来。说明搅拌式生物反应器球状载体培养同样能用于CV-A10的稳定、高效生产，在未来对搅拌式生物反应器不断地工艺优化中，可以实现更好的产量。
该研究将进一步提高培养效率，加快应对突发传染病疫苗研发的速度。Vero细胞和CV-A10在搅拌式生物反应器中的成功放大，为其在包括CV-A10的HFMD多价灭活疫苗和未来新发突发传染病疫苗中的应用提供了数据支持。
应用搅拌式生物反应器培养Vero细胞是病毒制备的关键技术，是重要的发展方向之一。生物反应器易操控，适合规模化放大，应用搅拌式反应器球状载体培养Vero细胞具有明显优势。生物反应器培养可获得更高的收益率，生物反应器的控制系统可以完成更多工作，可监测和控制的参数数量基于生物反应器中的传感器和控制元件数量，可以更好的进行培养工艺条件的筛选，优化。工艺简单、操作灵活，有良好的适用性；培养工艺容易放大，可为生物体生长和增殖提供均质的环境；产品质量稳定，适合工业化生产；提供较好的无菌条件，细胞生长过程中不易污染。
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本文章转载至《中国生物制品学杂志》
DOI：10.13200/j.cnki.cjb.004309
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