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2024/11/13 11:28:53PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶链式反应,可以选择性扩增一段DNA序列。其基本步骤是,首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链,DNA样品中,特异性的引物能够与其互补的序列杂交,在dNTPs和Taq酶存在时,就可以合成模板DNA的互补链,反应完成后,将反应混合物加热使DNA双链变性,温度下降后,过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸-变性-退火-延伸的循环可以重复多次,使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。PCR反应在生物体外大量扩增特定DNA片段的分子生物学技术,其特点是可以以微量的DNA为模板,快速扩增得到大量拷贝。
一、PCR反应条件的控制:
1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。
2. 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高,常用1.5 mmol/L。
3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制,20~200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。
5. 引物 浓度一般为0.1 ~0.5 umol/L。
6. 反应温度
(1)变性温度和时间95℃,30 s。
(2)退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。
(3)延伸温度和时间72℃,1 min/kb(10 kb内)。
(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7. 循环次数 :一般为25 ~30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低,可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右,循环数超过30个以后,DNA聚合酶活性逐渐达到饱和,产物的量不再随循环数的增加而增加,出现了所谓的“平台期”。
二、PCR的循环参数:
1. 预变性(Initial denaturation)
模板DNA全变性与PCR酶的全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2. 循环中的变性步骤
循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间,变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻di,易造成扩增失败。
3. 引物退火(Primer annealing)
退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。
5. 循环数
大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增。
6. 最后延伸
在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸全,并使单链产物退火成双链。