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引言

以人类或动物细胞、组织及体液等生物材料为起始原料生产的生物制品，在其制备流程及制剂阶段，可能会引入人或动物源的原材料及辅助物质。这些起始原料、添加的原材料以及所使用的辅料，均存在遭受病毒污染的潜在威胁。

为了有效控制生物制品受病毒污染的风险，国内外监管机构均出台相关法规，强制要求生物制品的生产流程必须包含能够有效灭活或去除病毒的工艺步骤，以此来确保最终产品的生物安全性。

病毒污染是构成治疗用生物制品安全性的重大威胁之一。过去，由于缺乏对病毒污染风险的充分认知，加之病毒检测技术与病毒灭活/去除手段存在局限性，血源性生物制品以及通过工程细胞与工程细菌表达生产的生物制品在生产流程中曾遭遇严重病毒污染事件。Table 1列举了部分生物制品遭受病毒污染的典型案例。

随着对生物制品病毒安全控制要求的不断提升，基于各国药品监管机构与业界长期积累的丰富经验，一系列针对生物制品病毒安全控制与评估的法规和技术规范相继出台。以下是本文在撰写过程中主要参考的相关法规：

病毒安全性评价范围

生物制品的上游污染来源分为内源性和外源性病毒污染两类。内源性病毒污染源包括工程细胞。工程细胞可能源于人的组织或器官、动物的组织或器官、植物的组织或其他来源。这些工程细胞一旦污染病毒，可能会带入到下游工艺，成为病毒污染的源头。对于外源性污染源，主要包括物流控制、人员控制、设施环境和过程监测。

以工程细胞来源生物制品为例，确保细胞库无污染是生物制品生产的重中之重。监管机构对细胞库的污染检测有明确严格的要求。细胞库鉴定要求人和哺乳动物细胞系从主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）到生产终末细胞（EOPC/CAL）的全面的细胞库检定。对于未处理收获液批次放行，要求每个生产批次收获的细胞/未经处理的细胞收获液（UPB）均需进行外源病毒和支原体的检测。其他来源生物制品的病毒污染来源分析和风险控制可以此为参考。

病毒清除定义及实施时间

在GLP实验室环境中，通过应用缩小模型，有目的的将一定量的模型病毒添加（即“加标”）至未加工的收获液或各生产步骤的中间体中。这一做法旨在定量评估灭活/去除病毒工艺步骤的有效性，具体通过测量病毒在工艺过程中的下降水平来实现，并据此确定工艺所能降低的病毒总体水平，以确保产品的安全性。

病毒灭活/去除工艺是保障生物药品安全性的核心环节。根据监管机构的严格规定，生物制品的生产流程必须包含能有效灭活/去除病毒的工艺步骤。在提交IND/BLA申请时，必须提供详尽的病毒清除研究报告。而在产品上市之后，根据实际需求或生产工艺的任何变更，还需对工艺步骤的有效性进行再次验证（Fig.1）。

Fig.1 病毒清除验证时间

指导原则中明确规定，一个典型的验证研究所选病毒应全面覆盖多种类型。具体要求包括：至少应包含单链和双链的RNA及DNA病毒、脂包膜和非脂包膜病毒、强弱抵抗力病毒以及大小颗粒病毒。

Table 2、Table 3、Table 4分别列出了CHO表达生物制品、杆状病毒/SF9表达系及血液制品中常用的模型病毒及主要特性。

Table 2. CHO表达系中可选用的模型病毒

Table 3. 杆状病毒/SF9表达系中可选用的模型病毒

Table 4. 血液制品中可选用的模型病毒

病毒清除工艺的有效性评估

法规中关于病毒灭活/去除有效性评估的内容明确指出了一系列标准，用以衡量工艺步骤的病毒清除效果。

具体而言，若验证研究中的工艺步骤能够使指示病毒数量被去除/灭活达到4个LRV（Log Reduction Value，对数减少值）或以上，则该步骤的病毒灭活/去除效果被视为有效。对于去除/灭活效果在1至4个LRV之间的工艺步骤，其病毒灭活/去除效果被认定为一般有效。然而，当工艺步骤的去除/灭活效果小于1个LRV时，其病毒灭活/去除效果则被视为不显著。值得注意的是，这些不显著的工艺步骤在评估总体工艺病毒灭活/去除效果时，其LRV数值将不计入总体工艺的病毒灭活/去除LRV总数之中，否则可能会对清除病毒的实际能力估计过高。这些规定为病毒灭活/去除工艺的有效性和可靠性提供了明确的评估标准。

在病毒清除工艺的选择与具体设计方面，我们需遵循一系列严格的原则和要求。首先，选择工艺时需确保至少包含一步有效的非包膜病毒清除步骤，这是保障病毒清除效果的基础。同时，工艺中还需至少包含两种从机制上能互补且有效的工艺步骤，以增强病毒清除的全面性和可靠性。

在具体设计工艺方案时，我们需进一步细化各项要求。首先，双申报去除/灭活病毒的验证研究必须符合GLP（Good Laboratory Practice，良好实验室规范）的要求，以确保研究的科学性和严谨性。其次，我们需要研究影响去除/灭活病毒效果的各项参数，包括机械参数和理化参数，并确定这些参数允许变化的幅度，通常通过验证最劣条件来确保工艺的稳定性和适应性。

此外，病毒灭活动力学的研究包括病毒灭活速率和灭活曲线的分析，有助于我们更深入地了解病毒灭活的动态过程。同时，为了更准确地评估病毒清除效果，指示病毒的滴度应尽可能高，以模拟最坏情况下的病毒负载。最后，在加入病毒进行验证时，病毒与待验证样品的体积比需控制在一定范围内，一般不超过1∶9，以避免因病毒浓度过高或过低而影响验证结果的准确性。

Table 5. 病毒灭活/去除工艺

采用80℃加热72h的处理方法可以灭活HBV、HCV、HIV和HAV等病毒。应该考虑制品的水分含量、制品组成（如：蛋白质、糖、盐和氨基酸）对病毒灭活效果的影响，应确定允许的制品瓶间各参数的差异，同时病毒灭活用的干热箱至少每半年验证一次。干热法适用于冻干制剂、凝血因子制品。

利用有机溶剂和非离子表面活性剂的混合物能够破坏脂包膜病毒的类脂膜。通常选择磷酸三丁脂 (TNBP) 和非离子化的去污剂（Triton X-100或PS80）组合。S/D法主要用于凝血因子制品、蛋白酶抑制剂、人免疫球蛋白等血液制品的脂包膜病毒灭活。因为S/D法引入有机溶剂，所以需要在后续工艺中去除加入的S/D试剂。

如Fig.2所示，使用mAb1和mAb2收获的细胞培养液(HCCF)进行实验，以评估温度和Triton X-100浓度对MuLV灭活的影响。对于这两种单抗，在12℃时的灭活速度比20℃慢，这表明较低的温度和较短的时间是最差的情况，A和B图对比表明0.3%和0.5%Triton X-100对MuLV的灭活效果无差异。

Fig.2 Genentech研究温度(A)、时间(B) 和Triton X-100浓度对X-MuLV灭活的影响

低pH灭活法针对包膜病毒而且要求样品在低pH条件下性质稳定。低pH灭活法是重组或者杂交的动物真核细胞经培养后表达、分泌的生物制品和直接采用动物组织原材料经提取、纯化制备的治疗用生物制品常用灭活方法。从病毒灭活效果的角度看：pH越低、孵育温度越高、孵育时间越长或者样品浓度越低，则灭活效果越好。

纳滤膜过滤法是当前可靠的病毒清除技术，主要基于尺寸排阻，利用病毒和蛋白大小的不同，小于平均孔径的蛋白通过滤膜，大于平均孔径的病毒截留在膜内，对各类病毒（包膜病毒和非包膜病毒）达到有效清除。使用20nm左右的滤膜对生物制品溶液进行过滤，去除指数通常可以达到4LRV以上，且不影响产品质量，有效且稳健。

利用病毒和目标产品在与层析介质接触时亲和力或其他相互作用方面的差别，实现各种组分的分离。层析方法包括亲和层析、阴或阳离子交换、复合模式层析等，Table 6列举了这几种层析方法去除病毒的能力。

层析技术去除病毒，需要考虑层析技术类型和层析填料使用次数（新、旧填料）对于去除病毒效果的差别，一般情况下，新旧填料的病毒清除能力没有显著差异。

药品申报新药研究申请 (Investigational New Drug, IND) 阶段的要求主要体现在模型病毒的选择、工艺选择和工艺重复性3个方面。Table 7列举了国内外血液制品和抗体/重组蛋白制品在IND申报阶段的要求。

Table 7. 国内外IND申报病毒灭活/去除验证要求

注：血制品中模型病毒选择时，水疱性口炎病毒（VSV）耐受的pH范围比较广，验证低pH孵育法灭活病毒效果时可选用此指示病毒。

药品申报生物制品许可申请 (Biologics License Application, BLA) 阶段的要求主要体现在指示病毒的选择、工艺选择和工艺重复性3个方面，同时要求更加严格。Table 8列举国内外血液制品和抗体/重组蛋白制品在BLA申报阶段的要求。

Table 8. 国内外BLA申报病毒灭活/去除验证要求

工艺参数要求

由于在生产规模上进行病毒清除验证研究是不现实的，验证只能按照生产工艺的缩小规模进行。缩小模型在关键参数及控制条件方面应与实际生产工艺严格保持一致。对于层析工艺，亲和层析和阴离子层析表现出有效的病毒清除能力，因此这两个层析步骤也常用于病毒清除验证实验。Table 9列举了亲和层析和阴离子层析（流穿模式）除病毒验证中的最差工艺条件。

Table 9. 工艺参数要求

在病毒灭活/去除的工艺验证中，病毒的检测方法要求高灵敏度、高特异性以及很好的稳定性和重复性。目前的病毒检测方法主要为噬斑检测法（定量）、细胞病变法（半定量）、核酸定量（定量检测）。

每剂量病毒颗粒估算

Fig.3 计算模型逆转录病毒的安全系数的例子

参考文献

[1] NMPA：生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价的技术审评一般原则，2005.12