胶原蛋白作为一种功能与结构兼具的蛋白质，在医药、化妆品及生物材料领域有着广泛的应用。随着胶原蛋白需求的快速增长，重组胶原蛋白的技术日趋成熟，逐渐成为主流的生产方式。本文将根据天然与重组胶原蛋白的特点，分别介绍其纯化工艺并分享相关案例。
胶原蛋白是一种在皮肤、骨骼及肌腱中广泛存在的结构蛋白，其基本单位由三条多肽链组成，形成稳定的三股螺旋结构。这种结构使得胶原蛋白在组织修复、组织工程及美容保健等领域发挥着重要作用。
天然胶原蛋白主要通过物理、化学或酶解等方法从动物组织（如皮肤、骨骼）中提取。常见的纯化方式包括：
• 酸碱水解法：将动物组织（如皮肤、骨骼等）清洁和切片、粉碎后，通过酸解/碱解作用将胶原蛋白从中溶解，再进行中和、过滤、浓缩换液等步骤得到胶原蛋白。
• 酶解法：将动物组织（如皮肤、骨骼等）清洁和切片、粉碎后，用特定蛋白酶进行酶解，再通过离心、过滤、浓缩换液等步骤分离出胶原蛋白。
然而，随着质量标准的提高，通过传统方法天然提取的胶原蛋白面临着杂质（如内毒素）的控制难题，这为后续的纯化工艺提出了更高的要求。博格隆的阴离子交换层析介质可用于纯化，以生产更高纯度的胶原蛋白。
重组胶原蛋白是通过基因工程技术生产的胶原蛋白，避免了动物源胶原蛋白的质量波动和安全隐患。
重组胶原蛋白的生产体系主要包括大肠杆菌、酵母等表达系统，具有产率高、成本低、周期短等优势。其工艺路线包括发酵表达、盐析、固液分离、澄清、亲和层析、离子交换和多模式层析等纯化步骤。
Fig.1 分离纯化流程
胶原蛋白的纯化工艺应根据表达系统和应用需求选择。若在构建时设计了标签，可采用亲和层析进行高效纯化；若无标签，则可根据胶原蛋白与杂蛋白的电荷、疏水性及分子大小等差异，选择离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析等方式，或通过复合模式层析进一步提高纯度。这些方法可灵活调整，以满足不同的应用和纯度需求。
亲和层析是一种基于特异性结合的分离方法，常用于重组胶原蛋白的初步纯化。通过在表达的胶原蛋白中插入标签，如His标签，对目标蛋白进行特异性结合捕获。
Ni2+对His标签具有特异性亲和，可以使用博格隆Ni Bestarose FF或Ni Bestarose HP等已鳌合金属离子的亲和填料进行捕获，通常一步可达到80%以上的纯度，杂质去除效果好。随后，再使用分子筛进行精纯以及浓缩换液，得到胶原蛋白原液。
Fig.2 亲和层析工艺路线
Ni Bestarose FF在组氨酸标签重组蛋白纯化中的应用
• 层析柱：EzFast 1mL
• 柱床高度：2.5cm
• 缓冲液A：20mM PB、0.5 M NaCl、20mM 咪唑、pH7.6
• 缓冲液B：20mM PB、0.5M NaCl、500mM 咪唑、pH7.6
• 样品：大肠杆菌表达带有组氨酸标签重组蛋白裂解液上清
• 流速：0.3mL/min
Fig.3 Ni Bestarose FF纯化组氨酸标签重组蛋白
离子交换层析基于目标蛋白质与杂质的带电荷种类和数量差异进行分离。胶原蛋白对pH敏感，适合偏酸性的缓冲体系，阳离子交换层析适用于大肠杆菌胞内可溶表达的重组胶原蛋白快速捕获。阴离子交换层析则是精纯阶段去除内毒素的主要手段。
Fig.4 离子交换层析工艺路线
Fig.5 Diamond CD-S纯化胶原蛋白
本案例中Diamond CD-S介质在线性梯度条件下展示了不错的分辨率，成功将重组胶原蛋白与杂质分离。
对于一些特殊的纯化需求，在离子交换层析中未能达到工艺要求的情况下，可选用多模式层析填料。复合模式层析能够同时利用电荷、疏水性等多种相互作用，提高纯化选择性。对比单一模式下的纯化方法，多模式层析可以通过改变pH、电导或者pH-盐双重梯度的策略进行洗脱，对样品有着更好的选择性。
Fig.6 复合模式层析工艺路线
Fig.7 Diamond MMC Mustang纯化胶原蛋白
胶原蛋白分子量较大，可以利用凝胶过滤填料进行缓冲液的置换，尤其在亲和标签切除后，去除亲和标签。
胶原蛋白的纯化技术不断发展，为组织工程、生物医药和美容保健等领域提供高质量的产品。无论是天然提取还是重组表达，合理的纯化策略和高效的层析介质是确保胶原蛋白产品质量的关键。博格隆层析介质以其优异的分离纯化效果和良好的批间一致性，广泛应用于胶原蛋白从实验室到工业化生产的分离纯化工艺中。
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