引 言
对于严重疾病和现有疗法无法治愈的病症，细胞和基因治疗是一种前景广阔的方法。目前，已有三款Car-T产品在国内上市。
尽管这些药物取得了成功，但是由于需要大量手动和开放操作步骤、有限的标准化和自动化以及较高的工艺变异性，相关药物生产仍面临严峻的挑战。
生物反应器系统能够帮助解决相关挑战：其允许通过自动工艺控制、在线工艺监测和工艺步骤(如进料或灌注)自动化减少手动操作影响和工艺变异性。摇摆式(RM)生物反应器是CAR-T等敏感细胞培养的一种有效工具，并且经常用于CAR-T细胞生产[1]。
目 的
• 摇摆式生物反应器中T细胞培养与传统静态细胞培养袋中细胞培养的比较
• 通过优化摇摆式生物反应器中的灌注补料方法提高培养生产率
方 法
• 细胞：从冻存PBMC(Lonza)富集的人原代T细胞，在T细胞培养基(添加5%人AB血清，200 U/mL IL-2)中预培养，使用TransAct™ (Miltenyi Biotech)活化。
• 细胞数量和活力测定：基于台盼蓝拒染法，使用CEDEX HiRes分析仪(Roche)
• 葡萄糖和乳酸测定：ABL 800 Basic(Radiometer)
• T细胞表型分析：iQue Screener Plus流式细胞分析
结 果
Biostat® RM TX生物反应器与静态培养袋的T细胞生长比较：
• 两种培养方式的参数保持不变(如细胞接种密度、培养基和补料)。
• 与静态培养相比，RM TX系统能够促进细胞生长(图1)。两种培养方法的细胞活力相当。
• 使用RM TX，第7天的活细胞密度(VCD)提高3倍以上(图1B)。
图1：(A)细胞生长显示为RM TX和静态培养中的增殖倍数和活力。(B)第7天活细胞密度(VCD)。使用相同细胞供体的3个培养物的平均值±标准差。
• 第2天后，与静态培养相比，RM TX的葡萄糖消耗量和乳酸产量更高(图2)。
• 对于静态和RM TX培养，培养结束时乳酸浓度趋于稳定并且水平相当。二者浓度接近但低于文献[2]中的1.8 g/L抑制水平。
• 两种培养技术在培养开始时都具有较高的葡萄糖消耗量和乳酸产量(图2)。
• 从第3天开始，葡萄糖消耗和乳酸生成减慢。这与接近培养结束时细胞生长速度下降相关(图1A)。
• 与培养方式无关的 CD3+ T 细胞类似百分比。
• CD4:CD8比值略有差异：RM TX培养后，辅助性T细胞(CD4+细胞)数量较少，效应T细胞(CD8 +细胞)数量较多。
图2：RM TX和静态培养袋的葡萄糖和乳酸测量。图中显示使用相同细胞供体的3个培养物的平均值±标准差。
图3：培养第7天T细胞表型的流式细胞分析。CD4+和CD8+细胞以CD3+细胞的百分比进行计算。图中显示使用相同细胞供体的3个培养物的平均值±标准差。
通过优化灌注策略延长培养时间并改善细胞生长
• 葡萄糖测定表明，低葡萄糖水平可能是细胞生长的限制因素(图1A和图2)。
• 当葡萄糖浓度降至0.5 g/L以下时，灌注率加倍。
• 通过增加灌注率使葡萄糖浓度保持在0.5 g/L以上，同时导致乳酸浓度下降(图4)。
• 利用优化灌注策略，使细胞在16天延长培养时间内基本呈现线性生长(图5)。
图4：RM TX培养物的葡萄糖和乳酸测定。直至第8天，使用方法中描述的补料策略。由于葡萄糖浓度在第8天降至0.5 g/L以下，从当天开始将灌注率增加至600 mL/天。
图5：采用高灌注率的RM TX培养细胞的细胞生长和活力(黄色)。采用标准灌注的RM TX细胞生长数据(图1)用于比较分析(灰色)。
结 论
与静态培养袋相比，Biostat® RM TX系统在摇摆混匀的条件下能够促进细胞生长(图6)。
培养液分析可以增加对工艺的理解并用于改进生产。本研究表明，通过分析葡萄糖等常见的培养基成分，可以改进生产率。
未来可将培养液分析扩展到氨基酸、生长因子和细胞因子等培养基组分，用于优化补料策略(批式补料、灌注速率等)，从而改善工艺性能并降低产品成本。
利用高灌注率培养，细胞密度接近5×107c/mL，即在Biostat® RM TX系统中每批次培养能够产生5×1010个细胞。该数量足以用于相关细胞治疗[3]。
图6：Biostat® RM TX系统配有自动控制单元和两个摇摆平台。与一次性Flexsafe® RM TX培养袋结合使用，该系统能够提供适合细胞生长的自动化、波浪混合和密闭环境。
Biostat® RM TX系统适用于工艺开发以及细胞增殖。该系统可用于分批补料、灌注工艺或不同培养模式的组合。
相关阅读
[1] Vormittag, P., Gunn, R., Ghorashian, S., & Veraitch, F. S. (2018).A guide to manufacturing CAR T cell therapies.Current Opinion in Biotechnology, 53, 164–181.
[2] Fischer, K., Hoffmann, P., Voelkl, S., Meidenbauer, N., Ammer, J., Edinger, M., Gottfried, E., Schwarz, S., Rothe, G. and Hoves, S. et al.(2007) Inhibitory effect of tumor cell-derived lactic acid on human T cells.Blood 109, 3812–3819
[3] Brudno JN, Kochenderfer JN.Recent advances in CAR T-cell toxicity:Mechanisms, manifestations and management.Blood Rev. 2019;34:45-55. doi:10.1016/j.blre.2018.11.002
