本生大课堂——ELISA实验可能出现的问题及原因分析

　　1.应该注意试剂4°c冷藏时水化层形成，蛋白分子分布异常;

　　2.标本由于冷藏时Ig G聚合成多聚体，Fib非特异性吸附，反复冻融机械切力致使蛋白分子受损;

　　3.加样时不准，枪头吸样时插入样本液面下2mm为宜;

　　4.常采用的温度有43、37°c、室温、或者4°c等。37°c常用，4°c效果好，但孵育时间有异;

　　5.要注意内源如风湿因子，补体，高浓度非特异性免疫球蛋白，异嗜性抗体及某些自身抗体等;外源如标本溶血，细菌污染，储存时间过长及凝固等因素影响。

　　6、在使用ELISA试剂盒时应注意：2-8℃保存(特殊情况除外)、同一品种不同批号试剂不能混用、不同品种试剂盒显色剂不能混用。

　　常见问题及分析

　　1、阳性对照不显色

　　漏加阳性对照

　　阳性对照孔忘加酶或忘加显色剂

　　阳性对照受污染

　　2、阳性对照显色浅(HBeAb HBcAb阴性对照显色浅)

　　试剂和保存不当、活性下降

　　在使用前试剂盒未放置在室温平衡

　　温育时间不够或孵育温度过低

　　洗板浸泡时间过长、洗板次数过多

　　使用不正确的洗液

　　洗液中含有防腐剂同时残留量过多

　　洗板后酶标板被干透

　　读数时使用波长不正确

　　滤光片不清洁或滤光片位置错误

　　读数时酶标板放置位置错误

　　阳性对照活性下降

　　酶标失活

　　3、阴性对照显色(HBeAb、HBcAB除外)

　　实验过程受污染

　　阴性对照污染

　　酶滴在孔壁上

　　4、整板不显色

　　试剂和保存不当、已经失活

　　忘记加酶、可检查滴瓶内酶量

　　忘记加抗原或中和试剂

　　忘记加显色剂A或显色剂B

　　5、阳性对照读数不正常

　　加入标本后未进行必要的混匀

　　标本稀释错误

　　加样量不正确

　　冷冻标本未溶解混匀

　　标本中含有防腐剂

　　6、血清本底高

　　试剂盒灵敏度高

　　加样时使用同一枪头、交叉污染

　　孵育时间过长或温度过高

　　洗板次数不足，浸泡时间短

　　洗板时洗液量少或残留量多

　　洗板时洗液量过多、串孔

　　洗板机管道中有霉菌生长

　　洗液瓶混用

　　洗板机洗板头阻塞或洗板机洗板头位置错误

　　配置洗液的去离子水或蒸馏水被污染

　　终止液浓度不够，没有充分混匀，或终止液被污染

　　读数时酶标板底部有水蒸气凝结

　　酶标仪偏差

　　7、假阳性结果

　　实验器具被污染

　　血清中出现纤维蛋白凝集

　　血清标本中出现过多的红细胞

　　血浆标本处理不当

　　标本中含有灰尘、颗粒或细菌等

　　标本被反复冻融

　　加标本后进行不正确的振荡

　　沿孔壁上加入标本，加样后出现过多的气泡

　　酶标滴加在孔壁上，洗板未洗净

　　混用洗液或洗液稀释错误

　　洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌

　　洗板次数不足或浸泡时间短

　　洗板时洗液量少或残留量多

　　洗板时洗液量过多、串孔

　　读数时酶标板底部有水蒸气凝结

　　洗液瓶、废液瓶混用

　　读数过程中板孔中有气泡

　　酶标仪偏差

　　8、同一板内重复性差

　　标本混匀不充分

　　试剂混匀不充分

　　标本与酶结合物混匀不充分

　　加样技术差异

　　加样器故障或加样器被污染

　　加样时间过长导致孵育时间不同

　　孵育器内部的温度不一致，造成酶标板孔间的孵育温度差异

　　读数时酶标板孔间有气泡

　　9、HCV血清本底高

　　灵敏度高

　　样本稀释液加液量不足100ul

　　枪头深入血清过深，致使外壁沾有血清导致加样偏多(>10ul)

　　同一孔加了两次样本

　　其他可能原因参考HBsAg

　　10、HIV阳性对照低

　　误将阳性对照稀释

　　阳性对照未混匀

　　加液量不足

　　其他可能原因参考HBsAg

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