标签：Western ELISA 山羊抗兔Ig 二抗 抗体  IHC 辣根过氧化物酶标记


　　辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)

　　来源：Goat

　　用途：WB, ELISA, IHC

　　WB：1:1000

　　ELISA：1:250

　　IHC：1:50

　　WB, Western blot; ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent Assay; IHC, Immunohistochemistry.

　　本辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L))为进口分装，用于Western、ELISA和IHC等的二抗。HRP，即horseradish peroxidase，中文名为辣根过氧化物酶，可以在Western检测时催化ECL类试剂(如ECL、BeyoECL等)产生化学发光，可以在ELISA时催化TMB产生蓝色，也可以在IHC或Western blot检测时催化DAB产生棕色沉淀。

　　本辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)用于WB、ELISA和IHC的推荐稀释比例参考上表，实际实验操作过程中需根据抗原和抗体的具体情况适当调节二抗的稀释比例。对于WB，推荐的稀释范围为1:500-2000。

　　本抗体为用纯化的兔IgG免疫山羊，然后用亲和纯化柱对获得的抗血清进行纯化而获得的二抗。

　　本抗体如果用于常规的Western检测，以每次检测需10毫升1:1000稀释的二抗计，至少可以检测100次。

　　山羊抗兔IgG(H+L),辣根过氧化物酶标记操作步骤：

　　(一)获得目的基因

　　1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

　　2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

　　(二)构建重组表达载体

　　1、山羊抗兔IgG(H+L),辣根过氧化物酶标记(Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjug)载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

　　2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

　　(三) 获得含重组表达质粒的表达菌种

　　1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。

　　2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

　　3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

　　(四)诱导表达

　　1、 山羊抗兔IgG(H+L),辣根过氧化物酶标记(Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjug)挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。

　　2、按1∶50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大约需3hr)。

　　3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。

　　4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%SDS重悬,混匀, 70℃10min。

　　5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。

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