mRNA生物制品质量控制家族成员全新亮相
时间：2023-10-08 阅读：3052
mRNA药物是通过将编码抗原蛋白的mRNA接种到人体，利用人体细胞内的遗传物质进行表达合成抗原蛋白，通过抗原蛋白诱导和激活机体的免疫系统产生免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。
由于其具有较低的感染和突变风险，能够同时诱导产生体液免疫和细胞免疫，免疫效能好，研发和生产周期短，容易实现量产等特点，目前被广泛用于传染性疾病、肿瘤及罕见病药物的研发。
通过酶促体外转录法制备大量mRNA的工艺已经成熟，其中规模化生产过程中主要涉及的工具酶有T7 RNA Polymerase、DNase Ⅰ、RNase Inhibitor、无机焦磷酸酶等，这些酶的灵活使用极大的方便了生产流程，加速科学家们研究进展。
T7 RNA聚合酶是由T7噬菌体DNA编码的，一种DNA依赖性的RNA聚合酶，具有高度启动子专一性，可催化以T7启动子序列为起点 5’→ 3’方向的RNA合成，在mRNA药物研发中常以其催化目的基因的体外合成，转录效率和产量高，市面上由其催化的1μg DNA模板可转录出150-200μg的RNA。
脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶，可以用于各种RNA样品的处理，消化由T7 RNA聚合酶催化的体外转录后的DNA模板，65℃加热10分钟可使DNaseI失活。
RNase（Ribonuclease，核糖核酸酶）是一类能够催化RNA降解为小分子RNA的核酸酶，广泛存在于真核、原核生物的所有细胞和组织中，通常有强活性，RNA样本中微量的RNase污染足以导致其降解。为了减少RNA的损失，适当添加RNase抑制剂（RNase inhibitor）是有必要的。
RNase抑制剂是人的胎盘中存在的一种特异性核糖核酸酶(RNase)抑制剂，能够特异地与RNase以非共价键结合形成复合体从而使RNase失活。
多种代谢反应会产生无机焦磷酸，Pyrophosphatas无机焦磷酸酶（PPase）可水解无机焦磷酸盐，可以避免无机焦磷酸对反应的抑制，并且提供热力学动力促使反应向正向进行，从而常用于RNA体外转录、DNA复制和扩增如HDA或LAMP等温扩增等。
尤其在工业化生产mRNA疫苗的时候会产生大量的无机焦磷酸盐，为了保证mRNA疫苗高效生产，可以添加无机焦磷酸酶，解除生成的无机焦磷酸盐对反应体系的抑制。
大多数工具酶的使用能帮助我们获得大量的RNA，但工具酶本身对于药物成品来说亦是一种杂质，这些杂质与mRNA一起通过LNP包封进入细胞释放后，极有可能产生高强度的免疫原性从而连带引发mRNA的降解。以及产生的双链RNA (dsRNA)杂质具有潜在的免疫原性，对患者有害。因此，mRNA相关制品需要测定和控制工具酶和dsRNA的含量。
——mRNA类的质量标准可以纳入外观、pH值、含量、鉴别、序列分析、mRNA完整性、加帽率、poly（ A）长度及分布、生物学活性、无菌检测、细菌内毒素、双链 RNA残留、溶剂残留等检测项目。
体外基因修饰系统药学研究与评价技术知道原则（试行）
--2022年05月
——mRNA等通过体外转录方式制备的核酸产品，可通过对原材料、转录模板和转录条件的研究，控制转录产物的质量。转录用的重要原材料，如核苷酸、修饰核苷酸、 5’-帽或类似物、工具酶（如转录酶等）等应进行适当的质量控制，可关注其纯度和杂质，转录酶还需关注其保真度等。
转录模板的制备应能确保模板的序列准确性和纯度，减少杂质残留。体外转录条件应经过充分的研究，提高转录序列的准确性、均一性和完整性， 减少副反应产物，如不完整 RNA、双链RNA、截短RNA、长链RNA等的形成。
体内基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）
--2022年05月
CDE发布的指导原则《病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》以及美国药典（USP）发布的《mRNA疫苗质量分析方法》的指南草案中（见下图）指出:需要对整个工艺进行质量控制，保证质量有效、安全可控。
其指导原则中还规定，需要对其生产工艺相关杂质进行检测，对主要杂质进行监测与分析，需要更强大的评估方法来确保最终产品的质量和安全。其中对T7 RNA和dsRNA的残留进行了明确规定。
疫苗行业
美国药典(USP)发布的《mRNA疫苗质量分析方法》指南草案
由于mRNA技术的应用相对较新，在药物研发和制造过程中指导mRNA质量研究与控制方面的监管指南和行业标准仍在不断发展。
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