随着微生物快检技术日渐频繁地应用于制药、干细胞和细胞治疗行业，替代方法验证成为了大部分质量管理和检验人员难以跨越的一个难题。

今天本文将通过Q&A的形式就相关法规和方案实践进行简单分享，Let's go！         

01

Q：关于快速无菌检查方法，中国药典有没有描述推荐的产品？

A：没有，根据ChP《9201药品微生物检验替代方法验证指导原则》，有推荐的检测技术。

9201 药品微生物检验替代方法验证指导原则

本指导原则是为所采用的的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。

随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术，大体可分为三类：

❶ 基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；

❷ 直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞计数法、流式细胞计数法等；

❸ 基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。

这些方法与传统检查方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时新技术的使用也促进了生产成本的降低及检验水平的提高。

02

Q：关于快速微生物培养方法，其它技术指南有推荐吗？

A：有，PDA《TR33 可选择的和快速的微生物检测方法的评价验证与执行》推荐了荧光染色发光技术，商品化产品为默克Milliflex Quantum快速微生物培养系统。

03

Q：关于快速无菌检查替代方法的验证，需要验证什么项目，怎样做？

A：无菌检查方法属于定性检验，需要验证专属性、检测限、耐用性、重现性；

▶ 专属性

目的：评估不同种类的微生物能否在规定的时间内生长；

方法：分别接种不大于100cfu的六种标准菌株(如有环境污染菌更佳)至特定培养基中，按特定的温度要求培养，接种缓冲液至阴性对照中；环境污染菌目前的应用有三种程度，1是不用，2是选用，3是分析用；

接受标准：5天内阳性对照的微生物生长良好，阴性对照无微生物生长，则设定5天为报阴时间；否则以微生物检出时间下限为报阴时间。

▶ 检测限

目的：评估样品中能被检出微生物的数量下限；

方法：方法同专属性，接种不大于10cfu的标准菌株；指导原则虽然推荐不大于5cfu的菌，但通过反复的实验证明，其较大可能会获得假阴性结果，参考指导原则中“确认其应用效果优于或等同于药典的方法”，其检测限不大于100cfu即可；

接受标准：5天内阳性对照的微生物生长良好，阴性对照无微生物生长，以菌落数目上限作为检测限。

▶ 重现性

目的：评估检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力；

方法：方法同专属性，两个人员，不同时间，各重复三次；

接受标准：5天内阳性对照的微生物生长良好，阴性对照无微生物生长，该接受标准高于卡方检验。

卡方检验：P值大于0.05则两种方法之间不存在显著性差异。

下图为例：

▶ 耐用性

目的：评估检验参数有变化时，其结果不受影响的能力，如对放置时间进行考察，则得出保存条件和时限的依据；

方法：样品放置于常温一定时间后，操作方法同专属性；

接受标准：5天内阳性对照的微生物生长良好，阴性对照无微生物生长，则设定5天为报阴时间；否则以微生物检出时间下限为报阴时间；