重磅上市 | AAV精纯工艺中高版本整体柱—CIM QA HR
时间：2023-11-17 阅读：2965
随着载体递送和基因编辑技术的快速发展，基因治疗已经成为许多遗传疾病和肿瘤疾病的治疗手段。
基因治疗中使用广泛的病毒载体包括腺相关病毒 (adeno associated virus, AAV)、逆转录病毒 (retro virus, RV)、慢病毒 (lentivirus, LV)以及腺病毒(adeno virus, Adv)等，其中AAV载体因其安全性好 、免疫源性低、感染特异性强、表达稳定等优势，已经成为最有前途的基因转移载体之一。
应用AAV载体进行基因治疗是一个快速增长的市场，截至2023年6月，已有7款AAV药物获批上市，其中诺华研发上市的治疗小儿SMA的Zolgensma药物，其在纯化工艺中使用的正是赛多利斯的BIA CIMmultus®整体柱。BIA整体柱以其大孔径、对流传质原理，不受孔隙度和扩散速率的的限制，允许在更高的流速下进行相互作用，能够使较大的病毒分子更容易与所有位点进行结合，大大提升生物大分子的纯化性能。
图1.全球已上市AAV药物汇总
BIA CIM Monoliths整体柱特性
No Crossflow shear
接下来，我们回顾下整体柱的特性
整体柱，一体成形的中空圆柱形整体结构，宽大均一且贯通的对流流道，剪切力很低，且具有成熟广泛的产品规格，易放大生产。高流速、高载量、高收率、高分辨率以及高效的五高特性，使其非常适合直径在20nm和200KD以上的生物大分子，目前已成为生物大分子的纯化利器。
图2.整体柱系列产品
图3.整体柱的结构和特性
AAV非亲和纯化平台
尽管腺相关病毒作为基因治疗的重要载体，已显现出巨大前景，但是AAV的产业化生产仍面临着诸多痛点，尤其在下游纯化工艺中，如产品纯度、不完整和空衣壳的去除、可放大性上都面临着一系列挑战。那么我们看看整体柱是如何应对和解决在AAV纯化领域的诸多挑战。
图4. AAV 样品下游纯化流程
CIMmultus™整体柱提供针对所有AAV血清型可放大的纯化解决方案，AAV的非亲和纯化平台是基于两个层析步骤-捕获(阳离子SO3)和精纯(阴离子QA或多模式PrimaS/PrimaT)，除层析纯化外，进入层析前的样品预处理也至关重要，在SO3捕获步骤之前，添加一步OH柱，能够提高层析柱的载量和终产品的纯度。
图5. 整体柱纯化AAV两步法和三步法流程
预捕获-捕获AAV颗粒
去除染色质、HCP、HCD等杂质
下游从收集细胞培养物的上清液或裂解物开始，预捕获步骤的主要目标是在此过程中尽快减少宿主细胞杂质，以防止进一步形成AAV-染色质复合物。
染色质表现出与包括AAV在内的任何物质形成复合物的电荷特性，这些复合物占据色谱柱上的结合位点。此外，位于染色质结构内的宿主细胞DNA更难检测和量化。由于其高致癌性和传染性，这种潜在的威胁也可能引发不良副作用。因此，预捕获步骤显著提高了产品纯度和色谱柱的载量。
预捕获步骤包括: TFF、OH柱层析，絮凝，固相萃取，沉淀或核酸酶处理等方式。当采用强阳离子交换剂作为捕获步骤时，可以采用酸性沉淀杂质的方式进行预处理。
SO3捕获(富集AAV particles)
使用阳离子交换柱CIMmultus™SO3在酸性pH(3.5 - 4.5)下进行捕获，去除大部分hcDNA和HCP，同时将AAV浓缩到目标浓度(1E12至5E13 vg/ml)，这一过程适用于所有血清型。研究证明，平衡缓冲液中加入一定浓度NaCl，对AAV的结合载量有提高作用。
SO3 操作条件与特性:
1.适合所有血清型
2.高流速，高分辨率，高载量(1E12 to 1E14 vg/ml)
3.低剪切力，收率高，可达80%以上
4.酸性条件pH 3.5 – 4.5下捕获，去除大部分hcDNA和HCP污染物，条件温和
5.可添加1%蔗糖与0.1% Poloxamer 作为添加剂
6.耐受1M NaOH清洗，可优化CIP条件，洗脱强结合杂质(组蛋白复合物)，提高柱子寿命和利用率
7.无需检测配基脱落，成本低
8.容易放大
图6.SO3 纯化AAV2/9层析图谱
QA精纯(分离Empty/Full Capsids)
基因治疗产品中Partial、Heavy 和Empty capsids的存在引起了越来越多的关注。空衣壳和不完整衣壳不仅影响治疗效果，还会导致不必要的副作用和可能的免疫反应，因此，将它们从产品中去除变得至关重要。
AAV空衣壳和实心病毒颗粒几乎具有相同的色谱特征，电荷差别很小，这导致了空/实衣壳的洗脱电导差异也非常小，同时结果会受到系统死体积、溶液、温度等影响，所以需要高分辨率的色谱介质来保证纯化工艺的稳定性。
CIM multus™QA柱是分离空满衣壳的主要手段之一，根据空/满衣壳的等电点差异(空衣壳PI在6.3左右，完整衣壳PI在5.9左右)，采用QA柱线性洗脱，在碱性环境下上样，随着盐浓度的增加，空衣壳比实心病毒颗粒先一步洗脱下来，从而实现空衣壳和部分衣壳的去除，有数据表明，镁离子的存在对分离效果有积极的作用。
QA 操作条件与特性:
1.高结合载量：1E13-1E14 vg/ml，取决于初始衣壳空满比，通常来说，空衣壳可减少1倍
2.适合于所有血清型纯化
3.空壳率<10%, 收率>80%
4.结合缓冲液：高pH值(8.5-9.5)和低电导率(2-5 mS/cm)
5.耐受1M NaOH清洗，寿命长
图7. AAV E/F 病毒等电点差异
图8. QA应用于AAV8 E/F分离层析图谱
图9.CIMmultus QA应用于AAV8 E/F分离的电镜图像
AAV三步法层析工艺
图10.AAV整体柱三步层析工艺
工艺特点与优势:
➣ 样品可以通过1:1 稀释，直接上样OH柱，以减少工艺时间和TFF剪切力影响，去除大量杂蛋白和核酸
➣ OH柱洗脱样品直接通过稀释酸化上样至SO3，继续去除HCP等杂质
➣ 阳离子洗脱液经过换液上样到QA，进行E/F的分离
➣ 以上工艺适合于所有血清型，更大化减少中间处理步骤，提高样品收率和生产效率
除以上经典的两步或三步工艺外，针对复杂多样的AAV样本，赛多利斯还提供多种层析方案供选择。
AAV 纯化工艺新思路—多模式整体柱
除CIMmultus QA外，多模式整体柱PrimaS和PrimaT在去除空衣壳和受损衣壳上提供了新的解决方案。
CIMmultus™ PrimaS
PrimaS是一种具有弱阴离子交换和氢键相互作用的多模式配基，与QA配基相比，具有不同的选择性，通过pH梯度进行洗脱，实现完整衣壳和空衣壳的分离，收率可达80%以上。
图11.Prima S纯化AAV2层析图谱
CIMmultus™ PrimaT
PrimaT是一种具有弱阴离子交换、氢键和金属亲和作用的多模式配基，已被成功应用于AAV空实衣壳的分离，并且Prima T可以分离更多的AAV亚群，且有助于更好地清除污染的DNA。
PrimaT适用于不同的AAV血清型，尤其针对一些难于分离的血清型，呈现非常不错的分离效果；如下图所示，AAV9在pH升高时与柱结合，在MgCl2梯度下从柱中洗脱。AAV9实心衣壳以单一的均质峰进行洗脱，洗脱峰260/280比值为1.37。空衣壳以盐梯度进行分离，AAV9实心衣壳的分步回收率，经由ddPCR测定可达100%。
图12.Prima T纯化AAV9层析图谱
AAV 精纯工艺中最高版本整体柱
CIM QA HR(High Reproducibility)
新品推荐: CIMmultus QA HR系列是新一代整体柱，能够实现色谱中最高的批次间和规模间的重现性，HR代表不同批次间和规模间的高度重现性。
CIM QA HR(高重现性)色谱柱，具有与标准CIM QA色谱柱相同的季胺配基，但实施了更为严格的放行标准和专业的测试程序，具有更好的分辨率和重现性，并将其优异特性应用于所有规格的层析柱，轻松实现生产的可放大性和可重复性。
CIM QA HR产品线包括所有标准的CIM色谱柱:制备应用从1 mL到8 L，以及CIM QA HR 96孔板，分析柱CIMac QA HR和工业级40L QA HR柱，结合新的分离方法，可以在任何规模下分离不同血清型AAV，从而实现富集完整的AAV病毒颗粒。
下图显示了标准QA和QA HR方法之间的区别。两种方法采用相同的CIMac QA分析柱进行分析，相同的CIMmultus SO3进行样品预纯化，QA HR方法显著提高了完整衣壳和其他非活性、潜在不安全衣壳之间的分辨率。色谱图显示了三种不同检测器，紫外、荧光和光散射监测方法的洗脱曲线，左图QA，右图QA HR
图13.QA&QA HR AAV分离方法对比层析图谱
优势:
✔ CIM QA HR放行标准更为严苛，基于AAV空衣壳洗脱的电导率值作为放行标准，允许在任何规模下使用相同的缓冲强度进行等度或梯度洗脱，实现不同批次和规模间的可重复性控制在±3%以内；
✔ CIM QA HR具有和CIM QA一致的季胺配基，且生产方式与CIM QA相同，QA HR cGMP系列的质量文件、法规支持文件与标准QA cGMP系列相同，这允许从标准QA生产线顺利过渡到新的QA HR生产线；
✔ CIM QA HR能够更好的实现空/满衣壳分离，分辨率较目前使用的方法高出5-10倍，能够在不损失产品的基础上，去除一个对数的Partial和Heavy capsids以及约两个数量级的Empty capsids；
✔ 不同规格的CIM QA HR产品，均具有相同的层析性能，轻松实现工艺的稳健放大。
结 论
面对AAV载体下游纯化的诸多挑战，赛多利斯旗下的BIA separation，能够提供完善先进的整体柱解决方案，针对所有AAV血清型均有效，多种配基类型和不同规模的非亲和纯化平台，助力AAV载体从工艺开发到大规模生产的线性放大。
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参考文献
1.CIM® SO3 Monolithic 96-well Plate for fast and efficient rAAV capture step screening after Kryptonase-TFF pretreatment 2022
2.Characterization of various AAV subpopulation species, separated by multimodal column PrimaT 2022
3.Chromatographic Separation of Full and Empty AAV8 Capsids 2022
4. CIM PrimaT - New multimodal ligand for separation of empty and full AAV9 capsids 2022