收集单抗时,针头滤器用量减半的好方法!
时间:2018-10-19 阅读:1626
以制备或分析为目的而澄清哺乳动物细胞培养液样本,对后续的纯化步骤及分析仪器的平稳运转*。澄清步骤的总体目标是去除细胞培养液中的细胞、细胞碎片及其它粒子,同时确保目标产物得到足量回收。小体积(约小于25mL)澄清的常规程序是先对细胞培养液样本进行离心,然后对离心后的上清液进行微孔过滤。尽管离心去除了一些粗糙的高密度粒子,但通常需要微孔过滤来去除离心上清液中的小粒子或低密度粒子。通过采用孔径为0.2或0.22μm的无菌级过滤器(称为除菌过滤器),微孔过滤还可同时发挥除菌灭菌的作用。
尽管离心步骤去除了绝大多数的粒子,但细孔过滤器往往会被堵塞,需要经常更换。这样一来,导致过滤器耗量增大,且不利于人体工学操作。然而,通过选择恰当的针头过滤器,可以减少过滤器耗量和相关操作时间。
本研究表明为CHO细胞培养液的澄清选择恰当的针头过滤器在提升样本通量的同时,还能减少过滤器耗量,不会对浊度、单克隆抗体产物回收率或总产率产生负面影响。选择市面上常见的两种孔径为0.22μm的无菌针头过滤器。尽管这两种过滤器的有效过滤面积存在轻微差异,但二者均有聚醚砜过滤膜。
为了改善细胞培养上清液的过滤以促进细胞株的发育,本实验进行了比较研究。我们基于以下参数:浊度、单克隆抗体回收率、相对产率、通量及过滤器用量,对Acrodisc®(颇尔公司,订单号:4652,有效过滤面积(EFA)=5.8cm2)和Minisart® High Flow (赛多利斯,订单号:16532-K,EFA=6.2cm2)针头过滤器的过滤性能进行了研究。研究采用了从为期三个月的实际科研项目中采集到的CHO细胞培养液样本。
在13个培养批次中,用到了十组目标蛋白和培养方法(见表1)。此外,还使用了125mL和1000mL摇瓶,以及5L的搅拌式生物反应器(赛多利斯 UniVessel)。采用贝克曼库尔特公司的 Vi-CELL XR 检测了细胞密度和存活率。作为目标蛋白,用来自不同IgG1、IgG2、fc融合蛋白及双特异性抗体的单克隆抗体筛选了CHO细胞株。基于保密协议,隐匿了后一种抗体的具体名称。
14天以后收集了所有的细胞培养批次;每一批次取两份样本(每种样本多31mL),一份用Acrodisc®过滤器澄清,另一份用Minisart® High Flow过滤器澄清。先将两份样本(4000g)离心澄清60分钟,然后将离心后的上清液分别用以上两种针头过滤器过滤(图1)。
图1:无菌条件下的初始澄清和随后用孔径为0.22μm的Minisart® High Flow针头过滤器对细胞培养上清液进行除菌过滤。
分别在未收集到的细胞培养液和利用FortéBio公司装有蛋白A生物传感器(Pro A)的Octet QKe系统收集到的细胞培养液中测定单克隆抗体滴度,无需进行任何麻烦的样液制备。由测定的滴度计算回收率。
对体积介于25mL~30mL的不同样液进行比较后,即可计算出每份样液的相对单抗产率(等式1)。
在澄清前后,用Lovibond公司的TurbiCheck WL 浊度计测量浊度值(白光光源)。然后,通过计算收集和未收集到样液的浊度比测定降低的浊度。
本研究的目的是基于粒子减少、单抗回收率、产率和针头过滤器耗量等参数,比较两种不同针头过滤器对澄清单抗上清液的适用性。
在实验中我们用到了多个培养体系和表达载体。利用这种方法获得了一系列不同的活细胞数、存活率、浊度、单抗产物和滴度(表1)。尤其是,收集的细胞培养液的浊度介于457NTU和1431 NTU之间;活细胞数范围:4 × 106~16 × 106个细胞/mL;存活率:48%~89%;单抗滴度(细胞培养液):0.2 mg/mL~8.8 mg/mL。结果的多样性是准确说明针头过滤器适用性的前提条件。
为了确定粒子减少量,我们分别测定了细胞培养液和滤液的浊度。结果表明两种过滤器均能去除上清液中的杂质粒子。Acrodisc®过滤器过滤后的滤液平均浊度为17.7NTU;Minisart® High Flow过滤器过滤后的平均浊度为17.6 NTU。当考虑整个澄清过程时,即将离心和过滤结合考虑,终结果为浊度相对降低93.8%到98.8%。滤液的浊度明显不依赖于初始细胞培养液的浊度(图2)。
图2:浊度降低幅度[%]与未澄清细胞培养液浊度的关系图。澄清过程包括离心和微孔过滤。浊度的降低不依赖于细胞培养液的浊度。这一点对Minisart® High Flow和Acrodisc®过滤器均适用(由于数据点几乎重合,因此图中未显示)。
表1:不同样液类型(表达载体|单抗产物)及其参数概览,如培养体系(STR = stirred tank reactor搅拌釜反应器,SF = shake flask摇瓶)、14天后的活细胞数(VCC)和存活率,以及收集细胞培养液的浊度。同时采用两种针头过滤器进行了澄清试验,以分别利用两种过滤器进行体积各异的澄清,从而获得客观的比较结果。
不同的细胞培养样液产生了一系列不同的单抗滴度:0.2g/L~8.8g/L。两种针头过滤器品牌产生滤液的单抗滴度范围均为0.2g/L~8.2g/L,终Minisart® High Flow过滤器的回收率介于89.9%到103.9%之间(平均回收率为97.7%),而Acrodisc®过滤器的回收率介于86.9%到107.3%之间(平均回收率为98.2%)。应该强调的是,回收率不依赖于细胞培养液滴度(图3)。这一点对不同浓度水平培养过程中单抗滴度的定期监测非常重要。
图3:单抗产物回收率[%]与未澄清细胞培养液单抗滴度的关系图;回收率不受针头过滤器类型的影响,Acrodisc®的平均回收率为98.2%,Minisart® High Flow的平均回收率为97.7%。细胞培养液滴度介于0.3g/L~8.8g/L之间时,未发现针头过滤器的使用对单抗回收率有影响。
尽管外壳设计和每份样液所用过滤器的数量有所差异,但对于两种针头过滤器来说,每份样液的相对产率均相同(图4)。
图4:多个单抗产物相对产率[%]的平均值。样液的相对产率为滤液中单抗总量与未收集细胞培养液中单抗总量的比值。终结果表明,尽管针头过滤器设计和过滤器用量有所差异,但两种过滤器的相对产率相同。
为了比较通量和过滤器用量,我们为每份样液确定了以下参数:上清液体积、总滤液体积以及所需的针头过滤器数量。Acrodisc®的平均通量为9.3mL,Minisart® High Flow的平均通量为18.0 mL(图5)。这种100%的差异无法用有效过滤面积(Acrodisc®: 5.8cm2,Minisart® High Flow:6.2cm2)的轻微差异解释。这种现象更有可能是因为过滤器所用聚醚砜膜的结构设计存在差异所致。终发现Acrodisc®过滤器的平均使用率是每份样液2.5个过滤器,Minisart ® High Flow的平均使用率是每份样液1.4个过滤器。
图5:CHO细胞培养上清液采用两种不同的针头过滤器(孔径:0.22μm)过滤:赛多利斯 Minisart® High Flow 和颇尔公司 Acrodisc®。测定了每个针头过滤器的平均通量。两种过滤器的通量差异可能并非由有效过滤面积的差异所致(Acrodisc®: 5.8cm2, Minisart® High Flow: 6.2cm2),可能的原因是过滤膜结构设计的差异。
以上结果表明Minisart® High Flow过滤器的不堵塞过滤体积大于Acrodisc®,并且在浊度、单抗回收率及相对产率等参数中同样体现出较高的性能。