做透Octet，发Nature！看看教科书级的实验设计
时间：2024-03-07 阅读：1344
如何评价一篇好文章？创新性和可信性才是关键标准，而非所用技术手段的复杂程度。近期，《Nature》发表的一篇文章，仅仅采用了两种主要技术手段便一气呵成。今天，就让陈老师带大家一探究竟。
人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染是导致艾滋病的原因，HIV要实现复制和传播，需要将遗传物质传递到细胞核内并整合进染色体中。近日，马克斯-普朗克研究所与麻省理工学院合作发表的一篇《Nature》文章[1]，揭示了HIV是如何进入核孔的。研究首先指向了核孔复合物(NPC)，它由约30种不同的核孔蛋白(Nup)构建而成，其中包括约10种所谓的FG-Nup，它们将形成屏障的苯丙氨酸-甘氨酸(FG)重复结构域锚定到NPC支架上，呈凝胶状，被称为FG相(FG phase)。这种FG相填充在核孔中，通常只允许核转运蛋白(NTR)通过，然而研究发现，HIV衣壳也可以滑过核孔的FG相。
图1. NTR和HIV通过NPC示意图
这篇发表在《Nature》杂志的文章所用的技术手段非常简单，主要通过激光共聚焦对核膜与HIV进行共定位，并利用Octet®非标记分子互作分析系统检测HIV衣壳蛋白CA和核孔蛋白(Nups)之间的分子相互作用。这两种技术一表型功能，一内在机制，二者相辅相成。特别是Octet®系统的分子互作数据，占据了文章相当的篇幅。
该文中关于Octet®分子互作的实验设计方案堪称教科书级别，值得我们一同细细品味：
在Octet®实验方法中，研究者们将来自五种不同Nups(Nup98、62、58、50和358)的八个FG结构域固定在链霉亲和素传感器上，将二硫键稳定的CA六聚体作为分析物。
图2.Octet®实验方法示意图
验证Octet®实验可行性之 1
分析物阳参对照设置
importin β超家族的成员是最大的核转运蛋白(NTR) 类，允许NTR及其货物复合物以非常高的分配系数进入核膜，所以原则上NTR是与FG Nup结合的理想阳性对照。
图3. Octet®结果显示：分析物importin β可以和含有FG结构域的Nup结合，其亲和力类似
验证Octet®实验可行性之 2
固化物阳性对照和阴性对照设置
据文献报道，CA可以和Nup153和CPSF6结合，所以Nup153和CPSF6可以成为良好的固化物的阳性对照。当然，与无关的固化物阴性对照Nesprin2没有结合。
|
|
|
图4. 左图：固化物Nup153与分析物CA六聚体的结合
中图：固化物CPSF6与分析物CA六聚体的结合
右图：固化物Nesprin2与分析物CA六聚体的结合
中图：固化物CPSF6与分析物CA六聚体的结合
右图：固化物Nesprin2与分析物CA六聚体的结合
可行性确认后，验证CA六聚体与不同Nups的结合强弱及状态。
CA六聚体可以与富含FG结构域的不同家族Nups快速动态结合，并且与分析物阳性对照Nup153和CPSF6亲和力相似，也与importin β亲和力相似。因此，CA六聚体可以广泛的与FG重复序列的Nups结合。
图5. CA六聚体与所有富含FG结构域的Nups结合，并且结合速率较快
结合特异性验证(分析物阴性对照)
Octet®检测发现FG结构域的Nups与CA-N57A突变(该突变会阻碍与Nup153和CPSF6的FG基序的相互作用)的亲和力减弱。
图6. 黑色虚线是突变体CA-N57A的亲和力，与未突变相比，亲和力大大降低。
基于生物层干涉技术的Octet®非标记分子互作系统是这篇《Nature》文章揭示分子机理的关键方法。一方面，因为在固化物和分析物上各种对照让结果更可信外，另一方面还因为Octet®系统具有以下优点：
• 非标记Direct binding是趋势，结果更准确
• 快速测定亲和力，更加定量化地表征分子互作
• 无洗涤步骤，可测弱亲和力(解离快)；本文的分子互作的解离都比较快，用传统的pull-down技术可能会被洗掉，导致假阴性结果
• 写入了美国药典，文章多，认可度广
• 万金油技术，可以用与检测DNA，小分子，蛋白质等各种生物分子
• 操作简便，耗材及维护成本低
只要把Octet®做透，发好文章不是难题！
-参考文献-
[1] HIV-1 capsids enter the FG phase of nuclear pores like a transport receptor.Nature,2024