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一文读懂如何用Octet做分子垂钓

时间:2023-11-23      阅读:2092

 


分子垂钓是生命科学研究中的一种常用技术,其基本原理就是从一个分子库(例如某个细胞裂解液)钓取可以与配体结合的受体分子。通常情况下,我们先将配体固定在固相中,然后让其与细胞裂解液中的分子进行结合,最后将结合的受体洗脱并交由质谱(MS)进行鉴定。
 
  基于生物层干涉技术(BLI)的Octet® 非标记分子互作系统能够快速、全自动、多通道平行地测试浓度和动力学常数。Octet® 的光纤生物传感器可以通过多种方法固化配体,这不仅可以提供减少非特异性的良好固相,而且可以与质谱(MS)进行搭配使用,形成BLI-MS联用技术。

 

 
   图1. BLI-MS的实验流程如下:
 
  •  将生物传感器浸入缓冲液中进行平衡
 
  •  将配体(例如抗体)固定到传感器上
 
  •  在用分析物基质平衡后,将加载配体的生物传感器浸入分析物溶液中进行结合
 
  •  经过短暂洗涤后,将捕获的分析物在低pH溶液中洗脱
 
  •  重复进行结合和洗脱步骤,在同一孔洗脱液洗脱并富集受体
 
  •  通过LC-MS/MS消化和分析蛋白质,从而鉴定分析物
 
  BLI-MS技术的可行性需要解答以下几个问题:
 
  
 
  •  需要多少量的目标蛋白才能进行有效的垂钓?
 
  •  钓出的背景蛋白数量是多少?
 
  •  是否可以观察到垂钓步骤的BLI信号?
 
  •  如果一次垂钓洗脱量不足,需要重复垂钓几次?
 
  •  这个过程的成本是多少?操作是否复杂?
 
   接下来,我们就根据一篇相关文章[1],和大家一起探讨BLI做垂钓的可行性。 

 

 
   图2. 垂钓方法开发思路:先从纯蛋白垂钓鉴定蛋白量下限,再检测高丰度和低丰度蛋白垂钓可行性

    BLI-MS可捕获和鉴定重组GFP  
 
  将GFP抗体固化在链霉亲和素(SA)传感器上,并让其与纯的GFP进行结合。通过LC-MS/MS方法对洗脱液进行鉴定,可以确认GFP已被成功捕获并从生物传感器中洗脱出来。GFP的MS信号强度与所用GFP的浓度成比例增加,检测阈值为0.63 nM,这意味着仅需3.38 ng的GFP就可以被垂钓和鉴定出来。这个实验结果验证了Octet® 进行垂钓的可行性。

 

 

   图3. 左上图:LC-MS /MS分析后,各浓度生物传感器洗脱液中的GFP蛋白MS1强度; 
  右上图:对数MS信号强度和浓度曲线图; 
  下图:使用Skyline提取的一种GFP肽(FEGDTLVNR)的离子色谱提取(XIC)信号

   BLI-MS可以捕获和鉴定细胞裂解物中带有GFP标签的蛋白质 
 
  为了在复杂的生物样品中测试BLI-MS方案,该研究使用Octet® 从表达融合蛋白胱氨酸素-GFP的小鼠成纤维细胞的细胞裂解物中垂钓GFP标记的蛋白质。使用固化GFP抗体的传感器,垂钓总蛋白100 μg、10 μg和 1 μg的裂解物,分别用30 个和 10 个结合/洗脱循环。文章设置了两个阴性对照:
 
    i   固化非相关 IgG 的生物传感器,从表达融合蛋白的细胞中捕获细胞裂解物
 
    ii   使用装载有GFP抗体的生物传感器,从转染EV(Empty Vector)的细胞中捕获细胞裂解物(不含GFP)
 
  在 100 μg ,10 μg裂解物的 BLI-MS 实验中,我们观察到了明显的GFP融合蛋白的BLI信号,而两个阴性对照没有,这说明有GFP蛋白已被成功垂钓出来。经过LC-MS/MS分析,我们在所有阳性样品中都检测到GFP,而两个阴性对照则没有,这进一步说明了Octet® 做为一种垂钓方法的良好特异性。随着循环数的增加和总蛋白量的增多,GFP信号增强,但同时背景蛋白数量也会增多。综合考虑,可以选择300 μg总蛋白量和10个循环的富集(耗费约1个小时)。

 

 
   图4. 使用Octet®从总细胞裂解物中分离GFP融合蛋白结果 
  Octet®传感图显示:含有总蛋白100 μg(A)、10 μg(B)和1μg(C)成纤维细胞裂解物中,实时鉴定垂钓GFP 融合蛋白的情况 
  直方图显示:在进行1个和30个循环(D、E、F)后,对洗脱液进行LC-MS/MS分析后GFP的MS1强度 
  堆积面积图显示:100 个和 10 个循环后从总蛋白1 μg(G)、30 μg(H)和 10 μg(I) 成纤维细胞裂解物中鉴定出的背景蛋白数量

    BLI-MS可从脾细胞裂解物中捕获和鉴定内源性CD16a  
 
  为了测试BLI-MS在复杂生物样品中捕获和鉴定内源性蛋白质性能,研究尝试从300 μg人脾细胞裂解物中垂钓CD16a。阴性对照是固化无关 IgG 的生物传感器。实验重复三次。
 
  在三次实验中,CD16a抗体包被的生物传感器上均有明显的BLI信号,说明有物质被钓出。经过LC-MS/MS分析,可以在阳性样品中检测到CD16a,而三份阴性样品中未检测到CD16a。相对于高丰度样品,虽然组织裂解物的蛋白背景更多,但是扣除阴性对照的蛋白后,阳性样品可以鉴定出10种特异结合的蛋白质,其中CD16a丰度最高,进一步说明了Octet® 用于垂钓的高度特异性。

 

 
   图5. 两份阳性样品的BLI结合图:红色为对照(固化无关IgG对照),绿色为阳性样品(固化CD16抗体)

 

 
   表1. 列出了固化CD16a抗体的生物传感器样品中专门鉴定的 10 种蛋白质(含每个样品的肽、总强度和种质名称)
 
 
    通过本文的实验,我们得出Octet® 做分子垂钓的如下结论:
 
  •  BLI-MS垂钓是完全可以行的
 
  •  对于高丰度和强结合受体,只需3-5个循环,且上样蛋白总量可以较低
 
  •  丰度低内源性蛋白垂钓也没问题,总蛋白量和循环数需要多一点,比如300 μg和30个循环
 
  •  时间为1-3小时(10-30循环),并且可以全自动化进行
 
  •  通常只需一根阴性对照传感器和一根样品垂钓传感器,耗材成本低于200元
 
    与传统方法相比,使用Octet®进行垂钓的优势在于:
 
  •  提供多种传感器固化已知分子,并且尽可能减少非特异性吸附
 
  •  通过垂钓的BLI信号,可以判断是否有物质钓出
 
  •  可以自动化多次循环,在同一个孔里富集洗脱样品
 
  •  将垂钓后的物质可以进行纯化,由于采用非标记实时技术,可以更可信的测定受体与配体的亲和力
 
    小伙伴们,立即利用你们手中的Octet® 的垂钓功能去发现新大陆吧!
 
 
  -参考文献-
 
 
  [1] BLI-MS: Combining biolayer interferometry and massspectrometry. Proteomics 2022, 22:2100031
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