一文读懂如何用Octet做分子垂钓
时间：2023-11-23 阅读：1934
分子垂钓是生命科学研究中的一种常用技术，其基本原理就是从一个分子库(例如某个细胞裂解液)钓取可以与配体结合的受体分子。通常情况下，我们先将配体固定在固相中，然后让其与细胞裂解液中的分子进行结合，最后将结合的受体洗脱并交由质谱(MS)进行鉴定。
基于生物层干涉技术(BLI)的Octet® 非标记分子互作系统能够快速、全自动、多通道平行地测试浓度和动力学常数。Octet® 的光纤生物传感器可以通过多种方法固化配体，这不仅可以提供减少非特异性的良好固相，而且可以与质谱(MS)进行搭配使用，形成BLI-MS联用技术。
图1. BLI-MS的实验流程如下：
• 将生物传感器浸入缓冲液中进行平衡
• 将配体(例如抗体)固定到传感器上
• 在用分析物基质平衡后，将加载配体的生物传感器浸入分析物溶液中进行结合
• 经过短暂洗涤后，将捕获的分析物在低pH溶液中洗脱
• 重复进行结合和洗脱步骤，在同一孔洗脱液洗脱并富集受体
• 通过LC-MS/MS消化和分析蛋白质，从而鉴定分析物
BLI-MS技术的可行性需要解答以下几个问题：
Q
• 需要多少量的目标蛋白才能进行有效的垂钓？
• 钓出的背景蛋白数量是多少？
• 是否可以观察到垂钓步骤的BLI信号？
• 如果一次垂钓洗脱量不足，需要重复垂钓几次？
• 这个过程的成本是多少？操作是否复杂？
接下来，我们就根据一篇相关文章[1]，和大家一起探讨BLI做垂钓的可行性。
图2. 垂钓方法开发思路：先从纯蛋白垂钓鉴定蛋白量下限，再检测高丰度和低丰度蛋白垂钓可行性
BLI-MS可捕获和鉴定重组GFP
将GFP抗体固化在链霉亲和素(SA)传感器上，并让其与纯的GFP进行结合。通过LC-MS/MS方法对洗脱液进行鉴定，可以确认GFP已被成功捕获并从生物传感器中洗脱出来。GFP的MS信号强度与所用GFP的浓度成比例增加，检测阈值为0.63 nM，这意味着仅需3.38 ng的GFP就可以被垂钓和鉴定出来。这个实验结果验证了Octet® 进行垂钓的可行性。
图3. 左上图：LC-MS /MS分析后，各浓度生物传感器洗脱液中的GFP蛋白MS1强度；
右上图：对数MS信号强度和浓度曲线图；
下图：使用Skyline提取的一种GFP肽(FEGDTLVNR)的离子色谱提取(XIC)信号
BLI-MS可以捕获和鉴定细胞裂解物中带有GFP标签的蛋白质
为了在复杂的生物样品中测试BLI-MS方案，该研究使用Octet® 从表达融合蛋白胱氨酸素-GFP的小鼠成纤维细胞的细胞裂解物中垂钓GFP标记的蛋白质。使用固化GFP抗体的传感器，垂钓总蛋白100 μg、10 μg和 1 μg的裂解物，分别用30 个和 10 个结合/洗脱循环。文章设置了两个阴性对照：
i 固化非相关 IgG 的生物传感器，从表达融合蛋白的细胞中捕获细胞裂解物
ii 使用装载有GFP抗体的生物传感器，从转染EV(Empty Vector)的细胞中捕获细胞裂解物(不含GFP)
在 100 μg ，10 μg裂解物的 BLI-MS 实验中，我们观察到了明显的GFP融合蛋白的BLI信号，而两个阴性对照没有，这说明有GFP蛋白已被成功垂钓出来。经过LC-MS/MS分析，我们在所有阳性样品中都检测到GFP，而两个阴性对照则没有，这进一步说明了Octet® 做为一种垂钓方法的良好特异性。随着循环数的增加和总蛋白量的增多，GFP信号增强，但同时背景蛋白数量也会增多。综合考虑，可以选择300 μg总蛋白量和10个循环的富集(耗费约1个小时)。
图4. 使用Octet®从总细胞裂解物中分离GFP融合蛋白结果
Octet®传感图显示：含有总蛋白100 μg(A)、10 μg(B)和1μg(C)成纤维细胞裂解物中，实时鉴定垂钓GFP 融合蛋白的情况
直方图显示：在进行1个和30个循环(D、E、F)后，对洗脱液进行LC-MS/MS分析后GFP的MS1强度
堆积面积图显示：100 个和 10 个循环后从总蛋白1 μg(G)、30 μg(H)和 10 μg(I) 成纤维细胞裂解物中鉴定出的背景蛋白数量
BLI-MS可从脾细胞裂解物中捕获和鉴定内源性CD16a
为了测试BLI-MS在复杂生物样品中捕获和鉴定内源性蛋白质性能，研究尝试从300 μg人脾细胞裂解物中垂钓CD16a。阴性对照是固化无关 IgG 的生物传感器。实验重复三次。
在三次实验中，CD16a抗体包被的生物传感器上均有明显的BLI信号，说明有物质被钓出。经过LC-MS/MS分析，可以在阳性样品中检测到CD16a，而三份阴性样品中未检测到CD16a。相对于高丰度样品，虽然组织裂解物的蛋白背景更多，但是扣除阴性对照的蛋白后，阳性样品可以鉴定出10种特异结合的蛋白质，其中CD16a丰度最高，进一步说明了Octet® 用于垂钓的高度特异性。
图5. 两份阳性样品的BLI结合图：红色为对照(固化无关IgG对照)，绿色为阳性样品(固化CD16抗体)
表1. 列出了固化CD16a抗体的生物传感器样品中专门鉴定的 10 种蛋白质(含每个样品的肽、总强度和种质名称)
通过本文的实验，我们得出Octet® 做分子垂钓的如下结论：
• 对于高丰度和强结合受体，只需3-5个循环，且上样蛋白总量可以较低
• 丰度低内源性蛋白垂钓也没问题，总蛋白量和循环数需要多一点,比如300 μg和30个循环
• 时间为1-3小时(10-30循环)，并且可以全自动化进行
• 通常只需一根阴性对照传感器和一根样品垂钓传感器，耗材成本低于200元
与传统方法相比，使用Octet®进行垂钓的优势在于：
• 提供多种传感器固化已知分子，并且尽可能减少非特异性吸附
• 通过垂钓的BLI信号，可以判断是否有物质钓出
• 可以自动化多次循环，在同一个孔里富集洗脱样品
• 将垂钓后的物质可以进行纯化，由于采用非标记实时技术，可以更可信的测定受体与配体的亲和力
小伙伴们，立即利用你们手中的Octet® 的垂钓功能去发现新大陆吧！
-参考文献-
[1] BLI-MS: Combining biolayer interferometry and massspectrometry. Proteomics 2022, 22:2100031