关于层析基质的选择题，你会怎么做？
时间：2023-06-09 阅读：423
各种层析方法层出不穷，令广大生物工艺工程师们眼花缭乱。本文将就如何选择层析方法提供相关指导，帮助用户选择更适合您应用的层析介质。
进行层析操作时，用户往往需要做出一系列重要决策。即使仅有一种层析介质(如传统填料)，用户也可采用多种不同类型的层析填料将宝贵的目标产物与污染物和杂质分离开来。更何况目前已有多种层析介质类型可选。用户面临的选择愈发多样，搭配灵活性也不断提升，要选出适合相关应用的最佳组合十分困难。
尽管很具挑战性，但我们仍可借助大量数据和信息做出符合科学原理和科学证据的决定。之前，我们探讨过了解目标产物和需要去除杂质的特性至关重要，并介绍了电荷、疏水性和配体结合亲和力等特性对分离效果的影响。我们可以利用这些特性来选择适合相关应用的层析方式，但不同的层析介质之间又该如何选择呢？
目前共有三种层析介质可供选择，用户很可能已对其中一种十分了解。这种了解和过往使用经验对决策影响巨大，往往能够表明用户使用该介质时已经获得长期成功和稳健工艺，经得起时间的考验。但当新机会出现时，明智之举是重新审视层析流程，并确认新产品是否足够出色，值得我们重新审视流程甚至替换旧产品。
在此，我们将详细介绍以下三种层析介质的不同特性：整体柱、传统填料和膜层析。希望大家能够从中掌握所需信息，在完全知情的情况下做出决策。
树 脂
树脂可以说是经典的层析介质，是检验新型层析介质的有用基准。尽管已问世多年，但层析填料仍然是目前众多分离工艺中的重要工具。
图 1——树脂层析法利用填装进层析柱中的小颗粒树脂进行分离。小颗粒树脂具有特殊的化学特性，可为目标分子(蓝绿色)或杂质(粉色)提供结合位点(黄色)。
也正由于传统树脂填料已经上市相当长时间，因此市面上生产厂家众多，产品也极其多样。其主干结构可由不同材料制成，也可适用于不同分离模式——离子交换层析(IEX)、亲和层析(AC)、疏水层析(HIC)和混合模式层析(MMC)常常都会用到树脂。用户可购买散装树脂，再小心将其填充进合适尺寸和规格的层析柱中，最后根据树脂特性用其分离不同的生物分子。用户也可购买预填充的即用型层析柱，广泛适用于从小型分析仪至中等规模生产运行等不同规模。
填料颗粒的关键特征之一是包含微孔结构，结合位点便位于其中。这意味着溶质分子必须由液相扩散进微孔中，才能发生结合。这一过程会降低分离速度，因为分子扩散总会受到限制，而且有效扩散需要在低流速下才能实现。
同时，微孔尺寸较小，无法结合非常大的分子和大颗粒。就大多数树脂而言，如分子大小超过 IgM(如 mRNA、质粒 DNA、病毒载体和外泌体等)，则只能扩散进一小部分微孔中的结合位点。而小于单克隆抗体的任何分子，其最大结合载量往往很高。
时至今日，传统填料已经成为应用最为广泛的生物分子纯化基质，涵盖从实验室到重大新药级生产的各种规模。其在单克隆抗体纯化等众多生物工艺中的应用已相当成熟。
整 体 柱
整体柱相对较新，其特点与传统填料区别显著。整体柱是由一整块聚合物制成的空心圆柱体，中间布满相互连接的通道。进行层析的官能团分布在互连通道的壁表面。与树脂不同，整体柱没有微孔结构，意味着质量传递不会受到扩散限制。相反，大量洗脱液可以携带待分离的分子、颗粒或囊泡流经通道，而质量传递仅通过对流实现。
图 2——整体柱层析法利用包含大量互连通道的整体结构进行分离。互连通道可为目标分子(蓝绿色)或杂质(粉色)提供结合位点(黄色)。
目标分子过大是考虑使用整体柱的首要因素之一，因为使用树脂层析大分子会导致扩散速度过慢，甚至无法进入填料颗粒的微孔中。而使用整体柱层析大分子则会大幅提高吸附效率，形成陡峭的流穿曲线并实现较高的结合载量。
整体柱层析与通过基质的流速无关，分离速度通常较树脂显著提高，有利于加快工艺速度并提高生产效率。不仅如此，整体柱也可用于快速去除腐蚀性杂质，此类杂质如与目标分子接触过久则可能破坏目标分子。
整体柱的另一大有用特性是通过层析床的流动方式主要为层流，可为对剪切应力特别敏感的 mRNA 等分子提供更加温和的层析条件。整体柱中的层流与层析填料填充床中的湍流形成鲜明对比。湍流，尤其是在高流速下形成的湍流，会产生强大的剪切力，从而破坏对剪切力敏感的分子。
除此之外，整体柱层析由于背压较低，特别适合分离高粘性原料。随着强化工艺的趋势日益流行，这一优势会变得越来越有价值。
整体柱适用于多种层析方法，包括 IEX、AC(如搭配 oligo dT 配)、HIC 和 MMC。产品通过即买即用型整体交付，大小不等，适用于研发实验室和生产。
膜 层 析
膜层析使用多层多孔膜进行分离，结合位点位于膜孔内。排列在膜堆中的膜孔携带流动相，即质量传递为对流方式。
图 3——膜层析法依靠多孔膜堆叠实现。膜孔中包含目标分子(蓝绿色)或杂质(粉色)的结合位点(黄色)。
膜层析的特点是速度快。膜堆厚度可选，以切实优化并实现快速分离。使用膜层析可以高流速实现大量进料。
除此之外，由于膜结构中的结合位点分布广泛且易于进入，因此膜层析法的分离效率十分出色。而对流传质也不会因扩散缓慢而形成时间限制。
快速分离对暴露于酶分解或其他破坏条件下的分子尤为有用。此类分子需要快速分离并转移至适合的非破坏环境中。使用膜层析法可降低目标分子在分离过程中被破坏的风险。
膜层析法拥有针对 IEX、耐盐 IEX 或 HIC的结合位点。层析膜也是即拆即用、无需装填，具有囊式和卡盒式多种规格可选，使用灵活，可轻松适应各种不同工艺。
膜孔径大，因此层析膜特别适合分离囊泡、病毒等大颗粒。但采用结合-洗脱模式分离蛋白质等小分子时，使用膜层析法很难达到高结合载量。相反，层析膜常被用于在工艺后期通过流穿方式去除杂质。此时层析膜可以结合最后的少量杂质，并让目标产物直接流过而不与结合位点相互作用。
在生物制造领域，膜层析法被广泛应用于在流穿模式下去除痕量杂质和污染物，在去除内毒素、宿主细胞蛋白质、DNA 和病毒污染物等方面已相当成熟。在结合-洗脱模式下，使用膜基质纯化病毒和核酸极其有效。
关于层析基质的最终选择
选择层析基质和分离模式不是非此即彼，即使有时会感觉选择了其中一种便放弃了其他所有。真实的纯化工艺通常比较复杂，需要进行多轮层析。在这种情况下，可能需要混合搭配不同层析基质和分离方法，才能确保在工艺流程的每个阶段都获得最佳结果。