图解中国药典控制菌检查法
时间：2021-08-24 阅读：20625
图解中国药典控制菌检查法（二）
方法适用性试验
试验菌：根据供试品所需检查的控制菌选择相应试验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时，采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。
依相应的控制菌检查方法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出相应控制菌。
若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性[见非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)中的“抗菌活性的去除或灭活”]，并重新进行方法适用性试验。
如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌成分消除相对*的方法进行供试品的检查。
供试品检查
供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。
阳性对照：对照菌的加量应不大于100cfu，应检出相应的控制菌。【耐胆盐革兰阴性菌检查中的阳性对照株使用大肠埃希菌或铜绿假单胞菌；梭菌检查中的阳性对照株使用生孢梭菌】
阴性对照：以稀释剂代替供试液，应无菌生长。如果有菌生长，应进行偏差调查。
3.1耐胆盐革兰阴性菌（Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria)
简述：耐胆盐革兰阴性菌是指能够耐受胆盐，在紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基中生长的革兰阴性杆菌，一般包括肠杆菌科、假单胞菌属、气单胞菌属等。其作为卫生指标，与大肠菌群有类似的指示作用。对于非无菌产品而言，检出耐胆盐革兰阴性菌或超标，指示生产工艺存在缺陷、原辅料受到污染、生产、储运缓解微生物污染控制措施失效等。
在紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基中生长的革兰阴性杆菌
根据标准规定选择定性或定量方法。若标准规定为“不得检出耐胆盐革兰阴性菌”，则选择“定性试验”检验；若标准规定为“耐胆盐革兰阴性菌应<10n cfu/g(ml)”，则选择“定量试验”检验。
试验步骤如下图：
通过选择性增菌，紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基中生长的菌应为革兰阴性菌，但仍需进行革兰染色进行确认。
阳性对照试验使用大肠埃希菌或铜绿假单胞菌，并在接种EE的步骤加入对照菌。
培养基：
3.2大肠埃希菌（Escherichia coli）
简述：大肠埃希菌为肠杆菌科埃希菌属的模式种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。除普通大肠埃希菌外，尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。
试验步骤如下图：
大肠埃希菌检查应鉴定到“种”水平。
麦康凯液体的培养温度为42~44℃，因为该条件是区分大肠埃希菌和大肠菌群其他“种”的关键条件，另外有文献报道表明：受到人和温血动物粪便污染的大肠埃希菌在42~44℃更容易生长。
大肠埃希菌在麦康凯琼脂中的典型菌落形态特征：鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。
大肠埃希菌在麦康凯琼脂上
结果与判定：MUG和靛基质试验可以作为确认的参考方法。IMViC试验亦可以作为鉴定和确认的参考。
培养基：
3.3沙门菌（Salmonella）
简述：沙门菌属是肠杆菌科的重要致病菌。在沙门菌的分类学研究和流行病学研究中，按照血清型进行分类更为常见，一般来说，O抗原抗血清的A-E群包含了沙门菌分离株的95%，所以可以用沙门菌A-F O多价血清进行沙门菌初筛试验。
试验步骤如下图：
药品中的沙门菌，是以鉴定沙门菌属为准。
与其他控制菌相比，沙门菌检查的取样量较大(10g或10mL的供试品)，经方法适用性试验，可适当增加TSB的体积，消除可能的抑菌作用。
使用RV培养基应控制预增菌液的加入量，一般要求1:100 ~1:2000之间。
沙门菌在XLD中典型菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。使用XLD时需注意：①培养超过48h可能造成某些微生物的假阳性；②某些变形杆菌菌株可能会出现黑心菌落；③甲型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌可能会形成无黑心红色菌落，与志贺氏菌混淆。
在TSI高层斜面试验中，建议同时接种沙门菌、大肠埃希菌或其他类似肠杆菌科的标准菌株作为对照菌，辅助判断斜面和底层的颜色反应。
沙门菌利用培养基中的葡萄糖产酸使斜面先变黄，生成的少量酸接触空气氧化，同时利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，使斜面变红。底层在缺氧状态下，细菌分解葡萄糖生成的酸类一时不被氧化而仍保持黄色。
培养基：
3.4铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
简述：铜绿假单胞菌为假单胞菌属菌种，本菌是常见的化脓性感染菌，在烧伤、烫伤、眼科及其他外科疾患中常引起继发感染，优于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性，增加了治疗的难度，国内外药典均将铜绿假单胞菌检查被列为外用制剂的检查项目之一。
试验步骤如下图：
铜绿假单胞菌检查应鉴定到“种”水平。
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(以下简称“CA”)上若有菌生长，均需要镜检鉴定。典型的铜绿假单胞菌在CA上形成蓝绿色菌落，在254nm的紫外灯下显荧光；有个别株不产绿脓菌素，但在254nm的紫外灯下仍显荧光。
铜绿假单胞菌在CA上
若需要进一步进行适宜的鉴定试验，可以进行绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验和明胶液化试验，判定如下图。
培养基：
3.5金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
简述：金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属中的一种。本菌可产生多种毒素及酶，这些毒性物质能引起局部及全身化脓性炎症，严重时可发展成为败血症和脓毒血症，是人类化脓性感染中重要的病原菌。金黄色葡萄球菌检查是外用制剂的检查项目之一。
试验步骤如下图：
金黄色葡萄球菌检查应鉴定到“种”水平。
典型的金黄色葡萄球菌在MSA上呈黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落，而表皮葡萄球菌则能使培养基呈红色。菌落呈黄色表示该菌很可能血浆凝固酶呈阳性，而菌落呈红色则表示血浆凝固酶呈阴性。
除MSA外，还可以将疑似菌落划线至Baird-Parker平板和血平板上。金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2~3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色(非白色)的边缘，周围绕以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰带。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色)，菌落周围可见*透明溶血圈。
确证的关键试验为血浆凝固酶试验，注意需同时进行阳性对照(金黄色葡萄球菌菌悬液)和阴性对照试验(空白培养液或稀释液)。
选择性平板上为典型菌落，革兰阳性球菌，血浆凝固酶试验阳性，则判检出金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌在甘露醇氯化钠琼脂培养基上
培养基：
3.6梭菌（Clostridia）
简述：梭菌属主要病原菌有：产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、肉毒梭菌和艰难梭菌等，均能产生强烈的外毒素使人和动物治病。因此对于某些用于阴道、创伤、溃疡的药品，必须控制梭菌。
试验步骤如下图：
梭菌检查需鉴别到“属”水平。
梭菌属细菌芽孢体对外界的抵抗力强，耐高温耐干燥，对新霉素、卡拉霉素、庆大霉素等抗生素不敏感。因此将供试液在80℃保温10分钟后迅速冷却，以杀死可能存在的杂菌繁殖体，使梭菌具有优势生长；或在哥伦比亚琼脂培养基中加入庆大霉素，抑制杂菌，利于梭菌的分离培养。
梭菌革兰染色镜检的典型形态特征为：培养后形成的芽孢，初呈“火柴头”状卵圆形，继而膨大呈球形，在菌体末端如鼓槌状。培养72小时以上时，菌体可自溶而消失，仅见游离的芽孢囊，一般染色时呈圆圈状。染色镜检有卵圆形至球形的芽孢，大于菌体，着生于菌体中央、次端或顶端，为梭菌典型形态。
鉴别梭菌的关键生化反应为过氧化氢酶试验，梭菌应呈阴性(无气泡形成)，可用枯草芽孢杆菌作为阳性对照(有气泡形成)。
培养基：
3.7白色念珠菌（Candida albicans）
简述：白色念珠菌又名白假丝酵母菌，属假丝酵母菌属。白色念珠菌是条件致病菌，是医学全身性真菌感染病的重要组成之一，一旦感染，常可引起心内膜炎、肺炎、尿布疹、鹅口疮、阴道炎、脑膜炎及败血症等。白色念珠菌广泛分布于土壤、水和空气中，目前国内外药品、食品标准已把白色念珠菌作为微生物检验中酵母菌的代表均，因此有些药品依据给药途径和剂型将白色念珠菌作为控制菌是非常必要的。
试验步骤如下图：
白色念珠菌检查应鉴定到“种”水平。
白色念珠菌在SDA中呈乳白色，偶见淡黄色，表面光滑，有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有褶皱。
培养基：
3.8补充说明
a.如果阳性对照试验中阳性菌未生长，则表明检验方法或检验过程存在干扰因素，应判断无效，并进行偏差调查，调查的因素包括培养基的配制、灭菌、培养基的适用性检查、试验器具的灭菌、检验的洁净环境、人员操作、方法适用性试验等。
b.如果阴性对照试验有菌生长，表明试验过程存在污染可能，试验结果无效，应进行偏差调查，调查的因素包括培养基的配制、灭菌、试验器具的灭菌、检验的洁净环境、人员操作等。
c.在检验过程中，发现有控制菌或不可接受微生物的检出，则认为是超标或异常检验结果，应立即启动OOS调查。对于药品检验机构而言，OOS调查即实验室调查，包括影响检验结果的所有因素，如试验人员、试验方法、取样程序、实验设备、试验器具、培养基、试验环境等，随着调查结果和流程，可以延伸到其他部门。对于生产企业而言，OOS调查包括实验室调查和生产环节调查。实验室调查包括上述内容，如果实验室调查认为实验结果有效，则应扩大调查至生产环节。一般来说，生产环节的调查包括检出菌特性分析(包括来源、危害、耐受性、是否会产生生物膜等)、检出菌的数量评估、检出菌在物料或终产品中的生长特性分析、生产的某些工艺是否对检出菌有抑制或杀灭作用、实验检出相同菌的历史调查、生产过程的详细分析(包括原辅料、水系统以及包装材料的检验、物料的转运、生产工艺参数、包装)等；通过生产调查，根据调查结果进行风险评估判断该产品是否放行，并查找根本原因，制订纠正和预防措施。
参考：
[1] 《中国药典》2020年版四部 1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法；
[2] 《中国药典》2020年版四部 9204微生物鉴定指导原则；
[3] 《中国药品检验标准操作规范》2019年版。