水溶Cy7 NHS ester|Cyanine7 NHS 使用操作步骤
时间：2018-08-02 阅读：1312
Cy7 NHS ester
氨基活性的Cy7,近红外荧光染料。此试剂可被用于产生Cy7-标记的生物分子，用于后续的小动物活体成像研究，药物设计及相关实验。Cy7中心加强聚亚甲基链的结构特点，与母结构相比其量子产率提高了20%，增加了其荧光亮度。
分子结构：
一般性质：
外观：绿色粉末
分子量：682.29
分子式：C41H48ClN3O4
溶解性：溶于有机溶剂（DMSO,DMF,二氯甲烷），不易溶于水
质控：NMR 1H(95%)13C,TLC,功能测试
保存条件：保存：-20℃，避光保存24个月。运输：常温下3周，避光，干燥。
光谱性质：
zui大激发波长：750nm
在zui大激发波长下的消光系数：199000Lmol-1cm-1
zui大发射波长：773nm
荧光量子产率：0.3
供应商：西安凯新生物科技有限公司
产品说明：
菁染料是性能优良的荧光标记染料，摩尔吸光系数在荧光染料中是较高的，其琥珀酰亚胺酯是 常用的脂肪氨基标记试剂，广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。通过改变 次甲基链的长度，可改变其荧光发射波长，每增加一个双键，按照Huoffman 规则正好红移约100nm。 菁染料Cy3 和Cy5 已成为基因芯片的推荐荧光标记物；另外，Cy5， Cy5.5 和Cy7 的吸收在 近红外区背景非常低，是荧光强度高、稳定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代 替放射性元素。但由于菁染料，尤其是不对称菁染料的合成副反应多， 副产物极性相近，产物的 分离提纯相当困难。菁染料特别是水溶性菁染料分子极性大，分离提纯越加困难。
图1. 脂溶性菁染料琥珀酰亚胺酯的结构式
图2. 水溶性菁染料琥珀酰亚胺酯的结构式
图3 菁染料琥珀酰亚胺酯的激发和发射波长光谱图
供应商：西安凯新生物科技有限公司
菁染料琥珀酰亚胺酯（CyDye NHS）的标记：
菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之间荧光强度高，F/P值过高荧光探针会自我淬灭并影响 生物分子的生物活性，标记生物分子适合是用单琥珀酰亚胺酯，但是用双修饰的CyDye NHS并没有 发现交联。CyDye NHS标记抗体在pH (8.5～9.4)时10分钟F/P可达5～6，而在pH 7.0几乎不反应。我 们用不同比例的Cy3标记anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗体发现用1:1，5:1，10:1 和 20:1 标记时得到的F/P值分别是 0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。
操作步骤：
一、 水溶性Cy3 NHS标记anti-GST多克隆抗体 市场上买到的抗体如果含有其它蛋白（例如serum albumin或gelatin等）或带氨基的缓冲液会影 响标记，在标记前需纯化。
1. 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗体(浓度为 0.5 mL at 3 mg/mL)，常温透析4小时。
2. 在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析过夜。
3. 第二天用1 L 0.1 M NaHCO3 (pH 8.3)透析4小时。
4. 用0.22 µm注射器过滤头过滤抗体溶液。
5. 用0.1 M NaHCO3 稀释少量的抗体，在280nm处测其紫外吸收值计算标记抗体的总量 （IgG antibody摩尔吸光系数170 000 M-1 cm-1 at 280 nm).
6. 用DMSO配置Cy3 NHS (MW 765.95) 溶液浓度为10 mg/mL；计算所需体积以得到想要的CyDye NHS 和抗体的比值(例如20:1)，然后慢慢将其加入到抗体溶液中，同时在暗处常温缓慢搅拌45 分钟。
7. 用1 L 0.15 M NaCl 溶液常温避光透析4小时除去未标记上的Cy3。
8. 在4°C用新鲜的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析过夜。
9. 用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% N3化钠溶液常温避光透析4小时， 在4°C常温避光再次透析过夜。
10. 用0.22 µm注射器过滤头过滤抗体溶液。
11. 用0.01 M PBS/0.01 % N3化钠整数倍稀释标记抗体溶液，测量280nm（蛋白）和552nm（Cy） 处的紫外可见吸光度。
12. 产品冷冻干燥成粉末或在 0.01 M PBS/ 0.01% N3化钠溶液中，-20℃避光储存。
F/P计算：
Cy3在552nm摩尔吸光系数为150 000 M-1cm-1；此蛋白在280nm的摩尔吸光系数为170 000 M-1cm-1；不同蛋白的摩尔吸光系数不一样；Cy3 染料本身在280 nm 的吸收是552nm处的8%。 按以下公式计算F/P值。 [Cy3] = A552/150000 [antibody] = {A280 - (0.08×A552)}/170000 F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A552}/ {A280 - (0.08×A552)}
二、 水溶性Cy5 NHS标记 (D-ser2)-leucineenkephalin
1. Cy5 NHS 1.0 mg溶解于400 µL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser2)-leucine- enkephalin acetate (YSGFLT，0.75 mg) 的400 µL DMSO溶液。（Dye 和peptide 投料比是 1:1）
2. 然后加入15 µL三乙胺，常温避光搅拌反应混合物过夜。
3. 用HPLC 纯化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上样注入2×400 µL，30分钟梯度洗 脱。从0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O（0.1% TFA）=70∶30，流速4mL /min。（对不同的蛋白 选择不同的合适HPLC梯度流动相）
4. 收集适当的色带峰，标记多肽的保留时间比未标记的多肽长。
5. 产品冷冻干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光储存；必要时可用质谱表征。
6. CyDye标记的蛋白稳定性取决于蛋白本身。例如标记的IgG在4 ℃可避光保存2月；更长期的保存 需加入等体积的甘油-20 ℃避光保存。
F/P计算：
Cy5 在650 nm 的摩尔吸光系数为250 000 M-1cm-1 ，所用蛋白在280 nm处的摩尔吸光系数为 170000 M-1cm-1；Cy5在280nm处的吸收是650nm处的5%。按以下公式计算F/P值。 [Cy5 dye] = (A650)/250 000 [peptide] =[A280 -(0.05×A650)]/170000 F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A650}/ {A280 - (0.05×A650)}
三、 水溶性 CyDye SE标记OLIGO
氨基封端的OLIGO可以标记CyDye SE，但是非常困难；标记前因为OILGO经氨水脱保护，请务 必洗涤掉所有的残余氨水。然后将样品真空干燥；然后溶于0.25 ml 的0.5 M NaCl 溶液中，用 Sephadex G-50脱盐，用5.0 mM borate 缓冲液平衡到pH=8.0，然后用以上硼酸缓冲液冲下OLIGO。 然后浓缩至干的样品溶于0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0)；在0.5mL碳酸缓冲液中30 nmoles的 OLIGO加入到CyDye SE的玻璃瓶中室温避光，密闭搅拌反应60min。反应物经Sephadex G-50或 RP-HPLC过柱纯化，冷冻干燥后避光保存。
注意：Oligonucleotides 和oligopeptides由于太小经常会留在过滤膜上或在冻存管内贴壁成膜， 而无法标记。
四、 小动物活体成像领域的应用
活体动物体内成像技术是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子 水平的定性和定量研究的技术。小动物活体成像是近年来在生物医药方面非常活跃和前沿的领域， 在研究细胞行为，药物活性和代谢，疾病的进展等方向取得了革命性的进步。分为生物发光成像（以 Caliper 和 Xengon 仪器为代表）和荧光成像（以 KODAK 和 CRI 仪器为代表）。
1、荧光成像的推荐步骤：
（1） SPF级 BALB/C裸鼠，6～8 周龄，18～20克，实验前24 h 自由进食、饮水。 （2） 于实验裸鼠腹腔内注射2% Pelltobarbitalum Natricum 300µL(215 mg/ kg)麻醉动物。将裸鼠俯卧位平放于小动 物多光谱活体成像系统的记录暗箱中。实验时将Cy7或Cy7标记的生物分子或药物应溶于水 （或甲醇/乙醇/乙二醇，有时DMSO 200uL能把小鼠杀死）稀释后，于裸鼠尾静脉注射200µL （浓度0.5 mg/mL），用量和时间需要客户根据自己的仪器和药物试剂等条件优化。每 5min 记录1 张动物在体内发射荧光的成像图片，分析荧光药物的分布情况。对照鼠不注射 药物，进行同时记录。记录结束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器，进行成像。
（3） Cy7 检测时激发波长700～770 nm 带通，发射波长790 nm 长通。液晶可调谐滤光片扫描范 围 780～950 nm，扫描步进10 nm。曝光时间为500 ms。不同的药物代谢时间不一样，注射入 裸鼠体内，荧光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈现显著的肾排泄的特点一般4～6 小 时，快的只有30 分钟；如果是骨骼和鼻腔等部位靶点的Cy7 标记药物，有客户反映一周后 活体成像系统仍能检测到荧光成像。器官切片观察：将解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醛固 定4 小时以上，0%，20%，30%PBS 蔗糖依次沉底，20µm 切片，多聚赖氨酸洗过的载玻片 贴片，晾干，DAPI 染色。共聚焦显微镜观察，激光器为氦氖 633 nm。
2、荧光成像常见问题
（1） 什么类型的小鼠适合活体成像？ 毛发对光有散射，建议用裸鼠。
（2） 给裸鼠注射的建议和大注射试剂体积？ 试剂的体积用量根据所采取的方式不同而不同，下面是体重 25g 的裸鼠注射量。 Route Recommended Maximal 静脉注射 Intravenous (IV) 50～125 µL 200 µL 腹腔注射 Intraperitoneal (IP) 500 µL 2 mL 皮下注射 Sub-cutaneous (SC) 100～250 µL 1 mL
（3） 注射针头的尺寸是多少？ 推荐使用具有固定针头的28～32 号结核菌素或胰岛素注射器（0.3 或1mL）
（4） 肿瘤成像需要注射多大剂量的标记抗体？ 推荐起始用量50µg 来优化合适用量。
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