一、目的要求：简要介绍石蜡切片的制作和苏木精、 曙红染色法(简称H.E染色法)，

　　借以了解石蜡切片制作的基本原理和一般方法。

　　二、实验用具：解剖器一套、单面刀片、切片刀、切片机、载玻片、盖玻片、标本瓶、烧杯、量筒、漏斗、染色缸、树胶瓶、酒精灯、毛笔、绘图纸、滤纸、熔蜡箱(或恒温箱)、展片台(或烫板)、小木块、蜡带盒、烤片盒、切片托盘。

　　三、实验材料：蛙或小白鼠。

　　四、实验内容：

　　(一)药品：

　　1、70%、80%、90%、95%酒精及*：

　　95%以下的各级浓度酒精是用95%酒精加 蒸馏 水稀释而成。简单的稀释方法：所需稀释的浓度是多少，就量取多少毫升原浓度的酒精，再加 蒸馏 水至该酒精的原浓度即可。例如，配制70%酒精，就量取70ml95%酒精，然后加入25ml蒸馏水即成。

　　2、固定液：

　　常用的固定液有10%福尔马林、Bouin氏液和Zenker氏液等。Bouin氏液在组织学切片技术方面应用甚广，配方如下：

　　苦味酸饱和水溶液 75ml

　　福尔马林 　　 25ml

　　冰醋酸 　　 5ml

　　3、蛋白甘油：

　　蛋白甘油是粘贴蜡片用的粘片剂。配方如下：取一新鲜鸡蛋的蛋白，充分搅拌成雪花状泡沫，然后滤去泡沫，加入等量甘油，使用磁力搅拌器搅拌均匀，再加入一小粒麝香草酚防腐。因甘油粘度较大 所以须用大功率的磁力搅拌器。梅颖浦的96-1大功率磁力搅拌器非合适本实验。

　　4、染色液：

　　以H.E.染色法为例，需配制苏木精染液和曙红染液。

　　⑴、苏木精染液：苏木精是一种碱性染料，它可将染色质染成蓝紫色。配方有多种，现介绍Harris氏苏木精的配制：

　　甲液： 苏木精 　 　 0.5 g

　　95%酒精 　　　 5.0 ml

　　乙液： 硫酸铝钾(或硫酸铝铵) 10g

　　蒸馏水 　　　 100 ml

　　　　　　0.25g

　　冰醋酸 　　　　几滴

　　先将甲液溶解，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水中，并加热使溶解，然后将两液混合煮沸，离开火焰后缓缓加入。冷却后过滤，加入几滴冰醋酸即成。

　　⑵、0.5%曙红酒精溶液：即0.5g曙红溶于100ml95%酒精中。 曙红是一种酸性染料，它可使多种细胞的细胞质染成粉红色或红色。

　　5、盐酸酒精：

　　盐酸酒精用于分色。配制方法是在100ml70%酒精中加入1ml盐酸。

　　6、其它：

　　二甲苯、切片石蜡、中性树胶等。

　　(二)、操作步骤：

　　进行组织学研究，必须把活的组织或器官制作成切片标本，以便在显微镜下进行观察。切片标本也就是利用组织的不同结构，经过染色后呈现出不同的颜色和不同的折光率而制作的。制片的方法众多，但基本要求是尽量保持结构的真相，切成薄的切片，应用不同的染色方法，使内部结构清晰易见。

　　石蜡切片法是zui常用的一种制片法。其制作过程是：取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片→脱蜡→复水→染色→脱水→透明→封藏。现分述如下：

　　1、取材和固定：

　　固定的目的在于保存组织内细胞原有的结构和形态，使其与生活时相似，因此要求固定的材料越新鲜越好。把动物杀死后应立即割取组织块，并快速投入固定液中。

　　将蛙或小白鼠快速剪去头部，打开腹腔，用锐利的刀片割取小块组织(肝、肠等)。 组织块的大小以厚度不超过5mm 为宜。 然后， 将取下的组织块迅速投入Bouin氏固定液中。固定时间为数小时至24小时(需视组织块的大小而定)。

　　2、冲洗：

　　经固定的材料，可根据不同的固定液，分别用水或酒精冲洗，以洗去固定液，否则固定液留在组织会有碍染色.

　　用Bouin氏液固定的材料,可直接移入70%酒精中，多换几次酒精，直至无黄色时为止。也可在酒精中加入几滴氨水或饱和碳酸锂溶液，以迅速洗去黄色。但留少许黄色也无妨碍。

　　浸洗后的材料若暂时不制片，可保存于70%酒精中。

　　3、脱水：

　　柔软并含有多量水分的组织是易切成薄片的，故必须增加组织的硬度。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织，以达到支持增硬的作用。但水与石蜡是不相混合的，因此，在浸蜡、包埋前须将组织中的水分*除去，这一步骤即为脱水。

　　常用的脱水剂是酒精。脱水时，先从低浓度的酒精开始，然后，递增浓度，直至*。具体方法是，将材料经70%酒精→80%酒精→95%酒精(Ⅰ)→95%酒精(Ⅱ)→*(Ⅰ)→*(Ⅱ)，各级酒精1-2小时。脱水应*，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。

　　4、透明：

　　酒精与石蜡不能混和，因此，脱水后的材料在浸蜡前，还必须经过透明。透明剂既可替代组织中的酒精，又能溶解石蜡，以利石蜡的渗入。二甲苯是常用的一种透明剂。

　　将脱水后的材料经1：1*与二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)，各级时间为0.5-2小时，务使组织达到透明为止。

　　5、浸蜡：

　　将已透明的材料移入熔化的石蜡内浸渍即为浸蜡。其目的是去除组织中的透明剂，而使石蜡渗入整个组织，获得一定的硬度和韧度，以便切成薄的切片。

　　先将装有56-58℃石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化，并使熔蜡箱的温度保持恒定(约58℃)，切勿太高或太低。 然后将透明了的材料放入蜡杯(Ⅰ)→蜡杯(Ⅱ)→蜡杯(Ⅲ)。浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为2-4小时左右。

　　6、包埋：

　　将浸蜡后的材料包埋于石蜡中，并使它凝固成蜡块，这一过程称为包埋。

　　包埋前，视组织块的大小先将绘图纸折成一纸盒，作为包埋的容器。纸盒折法如下：先折1、2线，次折3、4线，然后使a、b两折重叠，向外折出5线;同法折出6线，再折c线。zui后依同法折出7、8线及d线即成。

　　将纸盒盛满已熔化的石蜡，随即将第三杯中已浸蜡的材料放入其中，应注意切面朝下，位置放正。然后速将纸盒半浸于冷水中，待石蜡表面凝结后，将纸盒全部浸入水中冷却。石蜡全部凝固后，拆去纸盒即成蜡块。

　　7、切片：

　　切片前，先将蜡块用刀片修整成上下两边平行的正方形或长方形，否则切出的

　　蜡带弯曲不直，或无法连成带状。

　　将修整后的蜡块粘在小木块上，小木块装在切片机上，以待切片。

　　在旋转式切片机上将蜡块切成4-8um厚的薄片。切下的薄片连。蜡带。用毛笔轻轻取下蜡带，放在蜡带盒内备用。

　　8、贴片或烤片：

　　将蜡片粘贴在载玻片上即为贴片。用小玻棒蘸取一点蛋白甘油滴于一干净的载玻片上，用手指涂匀，并加几滴蒸馏水于载玻片上。 将蜡带按要求切成适当长度的蜡片，然后用小镊子将蜡片轻放在载玻片的水面上，再把载玻片放在展片台上(温度为45℃左右)。蜡片受热后即慢慢展平。待*展平后，用解剖针将切片位置拨正，倾去载玻片上的余水后，将其放在烤片盒中，置于50℃左右 恒温箱 内烤干。

　　9、染色：

　　染色剂多为水溶液，故染色前必须先经脱蜡、复水等步骤。染色方法众多，以H.E.染色法而言有下列步骤：

　　⑴、脱蜡：将烤干的切片放入二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)中，各为5min， 以溶去切片上的石蜡。

　　⑵、复水：是将脱蜡后的切片经各级浓度酒精逐渐下降到水的过程，即将二甲苯(Ⅱ)中取出的切片移入*→95%酒精→80%酒精→70%酒精→蒸馏水，各级中停留1-5min。

　　⑶、染色：

　　①、将蒸馏水洗涤后的切片移入Harris苏木精液中5-10min，使细胞核着色。

　　②、用自来水洗去切片上残余的染液。

　　③、用1%盐酸酒精分色数分钟。分色时就是褪去细胞质不应着色部分的颜色，而使细胞核着色得清晰适度。分色时需随时用显微镜检查切片，使分色适度。

　　④、入1%氨水或自来水浸洗，使之蓝化。

　　⑤、在蒸馏水中浸片刻。

　　⑥、切片入70%→80%→90%各1-2min。

　　⑦、入0。5%曙红酒精溶液中染色2-5min，使细胞质着色。

　　10、脱水：

　　切片依次入95%酒精(Ⅰ)→95%酒精(Ⅱ)→*(Ⅰ)→*(Ⅱ)，各级中停留1-5min。

　　11、透明：

　　切片入1：1*、二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(Ⅱ)，各级停留1-5min。

　　12、封藏：

　　将切片从二甲苯(Ⅱ)中取出，用纸或布擦去材料周围的二甲苯。在材料中央滴一小滴树胶，然后，用镊子加盖盖玻片。

　　切片封好后，放在切片托盘上待干燥，即可用不观察。

　　染色结果：细胞核呈现鲜艳的蓝色，细胞质及细胞间质呈粉红至红色。

　　(三)、注意事项：

　　1、制片是一个连续的操作过程，往往要连续几天才能完成，因此，事先一定要制订工作日程计划，应按顺序进行工作。这样可避免和其它工作发生冲突，也不会因前后顺序颠到或超过了规定的时间，给工作带来不必要的损失。

　　2、制片的各个步骤都是互相关联的，如脱水不*就会影响到透明的程度，以至影响蜡块的质量。为此，必须对任何一个步骤，都要细致、严格进行操作。

　　3、通过本实验可了解到每张切片都是来之不易的，因此，应倍加爱护，不要损坏。