产品名称：无内毒素质粒小量提取试剂盒

英文名称：Endo-Free plasmid mini kit

无内毒素质粒小量提取试剂盒包装规格：

有效期：本产品在常温(15-25℃) 干燥条件下可保存12个月。

产品原理和特点：

使用无胍盐质粒纯化方法，zui高可以获得高纯度的质粒50 μg，操作方便；过滤柱除去内毒素，使内毒素浓度<0.1 EU/µg；没有盐离子残留，提高测序、连接、转化和酶反应效率。

使用前准备事项：

1、使用本产品前，请务必仔细阅读说明书；

2、EFW(70%乙醇)在*使用前加入42 mL无水乙醇，混匀后使用；

3、Buffer RA在*使用前加入RNase A，2-8℃保存。

4、检查Buffer RB 有无沉淀。如有混浊现象，可在37 ℃水浴中加热至澄清；

5、全部操作均在室温进行，低温离心不利于酶去除 RNA；

6、从步骤“10”起，使用新的无内毒素的枪头转移液体并小心操作，可避免引入新的内毒素污染物。

操作步骤：

1、取大肠杆菌过夜培养液 1~4 mL，12,000 rpm室温离心 1 min，弃上清收集菌体。

2、向菌体中加入溶液 RA 200 µL，涡旋振荡，充分混悬菌体。

*不要残留菌块，会影响质粒得率和纯度。

3、加入溶液 RB 200 µL，立即温和上下颠倒5-7次，使之充分混匀，室温静置3 min，形成透明溶液。

*不操作不可剧烈，以免震断细菌基因组DNA；也不可超过5 min，以免破坏质粒完整性。

4、加入溶液 RC 200 µL，立即温和地上下颠倒 5~7 次，使之充分混匀。加入100 µL无水乙醇，颠倒混匀。12,000 rpm室温离心10 min。

5、将上清全部转移至套有过滤柱的结合柱中。12,000 rpm 室温离心 2 min，弃滤液。

6、将结合柱放回，向结合柱内加650 μL 80%乙醇（自备），12,000 rpm室温离心1 min，弃滤液。

7、将结合柱放回，12,000 rpm室温离2 min，除去结合柱内残留液体。

8、将结合柱放入新的1.5mL离心管中，敞口室温放置5~10 min 使乙醇充分挥发。

*残留乙醇将严重影响 DNA 洗脱。

9、向结合中加200 μL Elution Buffer，室温静置2~3 min，12,000 rpm室温离心1 min，弃掉结合柱。

*将Elution Buffer预热至60 ℃左右，可以增加洗脱效率。

10、向洗脱液中加入Buffer RE 200  μL，颠倒混匀，室温静置5 min。

11、加入Buffer NE 140 μL，颠倒混匀，并移入Endo-free过滤柱中，静置5~10 min。12,000 rpm室温离心2 min，弃过滤柱。

*静置5~10 min可使絮状物分层，利于过滤。弃过滤柱前，确认无液体残留，否则再次离心过滤。

12、向滤液中加入等体积的异丙醇（或者两倍体积的无水乙醇，自备），颠倒混匀后室温放置15 min，10,000 rpm离心15 min，弃上清。

13、加入500 μL EFW(70%乙醇)洗涤沉淀，12,000 rpm室温离心5 min，弃上清。

14、重复步骤“13”，尽可能弃上清。

15、敞口放置 5~10 min，使乙醇挥发，用适量EFW溶解沉淀。

常见问题解析：

质粒得率低可能原因及解决办法：

1、菌体未活化，生*率低，菌量少，需要活化菌种；

2、属于低拷贝质粒。增加菌液的量；

3、Buffer RB 裂解不充分。

质粒纯度差可能原因：

1、未加入RNase A 或RNase A未4 ℃保存；

2、加入Buffer RB 剧烈震荡，使得基因组断裂；

3、加入Buffer RC 操作慢，形成微小沉淀，蛋白质无法被充分漂洗干净；

4、OD260/OD280 比值一般在 1.8-2.0 之间，小于 1.8 可能有蛋白污染，大于 2.0 有部分降解或 RNA 污染。