洁净厂房到底如何进行灭菌设计？

2010版GMP显著提高了无菌药品生产的相关法规要求，与欧盟GMP接轨，提出了洁净区A、B、C、D分级以及相应更为严格的环境悬浮粒子与微生物的控制要求。眼下,全国各个无菌药品生产企业都在进行符合新版GMP无菌药品生产的厂房新建或者改扩建。而其中洁净厂房的灭菌设计也是其中较为关键的部分，新版GMP无菌药品附录1第四十五条认为：必要时，可采用熏蒸的方法降低洁净区内卫生死角的微生物污染，应当验证熏蒸剂的残留水平。这也就对新版GMP下洁净厂房的灭菌设计提出了较高的要求。本文结合笔者所在企业的经验,进行探讨。

设计原则讨论

无菌药品洁净区域的化学气体熏蒸灭菌（俗称大消毒），要求其可安全地使用于不锈钢、钢、塑料、玻璃、环氧地面、墙壁等各种表面，并对包括孢子在内的微生物进行快速、有效的灭菌控制，能通过对生物指示剂挑战性试验：经含菌量为105〜106和103的菌条灭菌后，应能够降低3个对数单位。

熏蒸一般为在位熏蒸，即直接在洁净室内部发生气体熏蒸，其经管道(包括直接通过空调净化系统管路或者单独的管路输送系统)进入洁净室进行熏蒸,而对此设计则需考虑灭菌后相应残留的控制水平。因此，灭菌方法设计应与空调净化系统中的排风与新风系统设计有关，通常希望新风在排废气时的进风量与回风量相等。此外，需要通过化学气体残留测试确认系统是否满足工艺要求的灭菌周期。

常用消毒剂介绍

臭氧

臭氧在常温常压下容易分解，形成氧气和单个的氧原子,后者具有很强的活性。由于臭氧自身的理化特性，是一种强氧化剂，具有强烈的消毒杀菌作用，从而决定它是一种广谱杀菌剂。生产臭氧的原料主要是空气和电能，一般通过高频臭氧发生器（电子消毒器）来获得，消毒时臭氧发生器发生臭氧后通过管路进入房间中。使用臭氧消毒的浓度很低，只有百万分之几，可根据房间体积及臭氧发生器的臭氧产生量来计算得到。

臭氧具有的较为明确的优势是氧化能力和杀菌能力很强，不产生任何毒留残物，具有广谱性与经济性，操作简单。但是其缺点也非常明显，即高浓度对人体有害，与设备表面和建筑材料的兼容性较差，容易使铜片出现锈斑，橡胶老化，且其灭菌环境要求相对湿度>60%等。

甲醛

甲醛是一种无色、有强烈刺激型气味的气体。甲醛在常温下是气态，通常以水溶液形式出现。易溶于水和乙醇，35%〜40%的甲醛水溶液叫做福尔马林。甲醛杀菌效果的3个重要因素：提升温度、限定相对湿度和改进穿透条件。温度对甲醛气体的杀菌作用有明显的影响。当相对湿度在65%以上,温度在24〜40°C时，消毒好。甲醛熏蒸由于操作方法简单、价格低廉而应用较广，甲醛杀菌作用强，对细菌繁殖体、芽孢、分枝杆菌、真菌和病毒等各种微生物都有高效的杀灭作用，属于比较悠久的传统熏蒸方法。但是甲醛作为较高毒性的物质，具有强烈的致癌和促进癌变作用，也是潜在的强致突变物之一。所以，应用受到限制，欧盟GMP明确规定不能使用甲醛进行洁净厂房灭菌。甲醛气体的穿透性差，一般不能穿透到物品包的中心或导管的内部，不易精确控制操作过程中气体浓度，也不能保证影响甲醛杀菌能力的因素得到有效的控制，作用周期也较长，房间灭菌一般要过夜。

VHP

汽化过氧化氢(VHP)灭菌技术，是利用过氧化氢在常温下气体状态比液体状态更具杀孢子能力的优点，经生成游离的0H_,用于进攻细胞成分，包括脂类、蛋白质和DNA，达到灭菌要求的一种技术。常用于隔离室、隔离器等密闭空间的灭菌。汽化过氧化氢(VHP)灭菌干燥、作用快速、无毒无残留，物质相容性较好，包括很多金属和塑料，适用于房间、生物安全柜、传递窗、动物笼交换站、隔离器和医疗器械等表面的灭菌消毒。生物净化时间短，根据待处理产品的物理特性，生物灭菌时间30〜90min,对更广犯围的微生物有效，生物灭菌循环中不产生有毒残留物，对于其他物品影响不大（装置、电器、洁净室墙板等）灭菌所需时间短，容易验证。缺点是汽化过氧化氢要做到汽化较难，做到的汽化过氧化氢造价往往比较昂贵。

过氧化氢+过氧乙酸混合液体

将过氧化氢和过氧乙酸混合，由压缩空气管道和不锈钢雾化喷头及装有消毒剂的喷壶组成一套独立的灭菌系统，由压缩空气总阀控制消毒剂的流量，使消毒的剂量、温湿度、时间和雾化可控、可调、可验证，避免由于过滤器穿透状态不同而产生消毒效果的不确定。由于过氧化氢和过氧乙酸都具有较强的氧化性，其具有较好的杀孢子的能力，但是同样也对设备表面的腐蚀性大大加强，一般容易引起生锈、起泡等不良效果，影响了其应用。

环氧乙烷

环氧乙烷为气体杀菌剂，杀菌谱广，杀菌力强，属高效灭菌剂。环氧乙环在低温下为无色液体，沸点10.8℃,在常温下为无色气体，易燃、易爆、空气中浓度达3%以上，即有爆炸危险。环氧乙烷的杀菌原理是通过对微生物蛋白质分子的烷基化作用，干扰酶的正常代谢而使微生物死亡。其主要优点是广谱、高效，能杀灭一切微生物，穿透力强，可穿透玻璃纸、聚乙稀或聚氯乙烯薄膜和一般硬纸盒。其缺点是灭菌时间相对较长,环氧乙烷气体易燃易爆,残余物具有毒性，需要进行评估。

综合比较

综合比较如表1所示，从表1可知：目前洁净厂房灭菌应用较广的仍然是臭氧、甲醛以及VHP，而这其中在国内应用的还是甲醛。

设计应用介绍

下面以常用甲醛熏蒸的灭菌设计加以介绍。

系统组成与结构

甲醛由蒸发器反应罐加热经空调系统管路进入洁净室,静置熏蒸，达到灭菌效果，灭菌结束后，启动新风送风,将甲醛气体排出洁净室外。甲醛经空调管路熏蒸灭菌洁净室如图1所示。'

系统操作方法

首先利用空调系统加热和加湿装置对洁净室进行加温和加湿，温度达到35〜40°C之间，湿度达到65%以上，同时关闭新风/隔断新风补充，洁净区内各排风风机必须关闭。计算每个灭菌点的房间体积，并按10mL/m3的浓度将36%的甲醛溶液定量甲醛加入消毒锅，加热30min后，甲醛蒸汽经空调管路压入洁净室30min,静置约12h,洁净室温度一直维持在35〜40V之间，湿度达到65%以上。然后，打开新风阀门至规定位置，打开排风风门，经过2h后，关闭排风阀门，调节蒸汽加热阀和冷冻水阀门，使洁净区的空调系统正常运行。

洁净区空气甲醛灭菌流程图如图2所示。

灭菌效果确认与残留检测

灭菌效果通过洁净环境监测以及生物指示剂挑战法。甲醛气体熏蒸灭菌结束后，对相应的机械表面、内部及缝隙，墙壁、窗台表面进行表面擦拭确认，使用接触平皿在表面进行取样，取样后于30〜35°C培养2天,20〜25°C培养3天,没有细菌生长。在洁净室各功能房间中放入直径9cm经170°C、2h灭菌的玻璃培养皿,并放入枯草黑色变种芽孢生物指示剂(枯草芽孢杆菌菌片,含菌量>106个），每室放置2点，每点2片。灭菌结束后，回收，按梯度稀释法培养检验，每个菌片含菌量应降低3个对数单位。

甲醛残留检测采用手持的甲醛浓度探测仪进行检测，当浓度达到室内环境质量标准后才允许其他工作人员进入。

甲醛熏蒸灭菌另外有直接安装在洁净室内，由压缩空气管道和不锈钢雾化喷头及装有甲醛的喷壶组成，由压缩空气总阀控制压缩空气的流量，利用压缩空气通过喷头时使甲醛雾化，进行空间环境的消毒和灭菌的设计，消毒后在排风机箱处排放。

结语

经过上述洁净厂房灭菌主要消毒剂的介绍，可以了解到我国制药企业目前主要应证，以及其对物料，尤其是橡胶的兼容性较差，而应用偏少。而一般的汽化过氧化氢灭菌由于较难做到汽化，而较难达到灭菌效果，或者对彩钢板，设备表面等兼容性较差，无法满足设计要求，而像美国STERIS公司的低温汽化过氧化氢（VHP)MD系列灭菌系统又造价昂贵,成本很高无法大面积推广。故而，目前甲醛熏蒸仍是既能够符合2010版GMP要求，而又相对经济实惠的主要洁净厂房灭菌方式。