超全荧光定量PCR应用常见问题汇总!
时间:2024-11-11 阅读:226
实时荧光定量技术是什么
20世界90年代由美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术(Real-time qPCR),其基本原理是在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光染料探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。荧光定量PCR最大的优势可以对初始模板进行定量,目前已广泛应用于生命科学、医学研究等领域。
常见问题罗列
没有CT值
实验结果一旦遇到没有Ct值情况,就要在第一时间排查是否有以下问题:
CT值过晚
在相对定量中,Ct值一般控制在15~25之间比较好,如果在绝对定量中,对低拷贝数的样品,Ct值会增大,但是一般不宜超过40循环,否则定量不准确。因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况,需要根据具体实验设计和目的进行。
标准曲线线性关系不佳
如果遇到标准曲线线性关系不佳R2<0.9)的情况,那么很有可能是以下环节存在问题:
(1)标准品稀释或者加样存在误差,吸样不准,使得标准品不呈梯度;
(2)标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,将高浓度DNA模板分装,保存于-20℃或-80℃,不要反复冻融,现配现用;
(3)引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针;
(4)模板中存在抑制物。模板浓度过高,根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求,一般模板量不超过500ng,以50~500ng为宜。
阴性对照扩增有信号
如果阴性对照扩增有信号,首先排查各操作环节是否有不当,造成交叉污染:
(1)引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
(2)引物浓度不佳。适当降低引物浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
(3)镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix试剂盒。
(4)模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。
(5)交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染,或操作环境中有气溶胶造成污染,建议对操作环境进行处理,或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。
熔解曲线峰不特异
如果熔解曲线峰不特异,那么很有可能是以下环节存在问题:
(1)引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现,这是最主要因素;引物浓度不佳,尤其是涉及二聚体存在时,适当降低引物浓度,并注意上下游引物的浓度比例;
(2)离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的mix试剂盒,不同试剂盒在该方面的优化能力不适合,有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果;
(3)模板有基因组污染。RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。
扩增效率低
该情况适用于针对所有的基因,特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应考虑如下情况:
(1)反应试剂中部分成分比例是否最佳,另外考虑荧光染料是否降解;
(2)反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法,适当延长变性退火时间;
(3)反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入的,应先把模板适度稀释,再加入反应体系,减少抑制物的影响。
扩增曲线的异常
如果遇到扩增曲线异常,比如“S”型曲线等等情况,那么很有可能是以下环节存在问题:
参考文献:
Troubleshooting Guide for qPCR and RT qPCR kits (EUROGENTEC)