动物组织中DNA的制备
时间:2024-12-21 阅读:29
动物组织中DNA的制备
(一)原 理
DNA是所有生物体的基本组成物质。真核生物DNA主要存在于细胞核中。制备DNA时应将细胞核膜打破方能释放出来。
细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合,形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在细胞破碎后,这两种核蛋白将混杂在一起。因此,要制备DNA首先要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度,如在0.15mol/L NaC1的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度最大,脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小(仅约为在纯水中的1%);而在l mol/L NaCl的浓盐溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度增大,至少是在纯水中的2倍,核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性,调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此,在细胞破碎后,用稀盐溶液,反复清洗,所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。
分离得到的脱氧核糖核蛋白,用十二烷基硫酸钠(SDS)使蛋白质成分变性,让DNA游离出来,再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点,加入95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来,获得产品。
当细胞破碎时,细胞内的脱氧核糖核酸酶(DNase)立即开始降解DNA,如果在破碎细胞后不及时采取抑制酶活的措施,最后将会得不到任何DNA。为此,如在本实验中加入柠檬酸盐、EDTA等螯合剂以除DNase必需的Mg2+离子,使DNase活性降低,并要求整个分离制备的过程均在4℃以下进行,以减少DNase的降解作用,最后加入SDS使所有的蛋白质(包括DNase)变性。当然如果希望获得更大分子的DNA时,则在细胞破碎后,及时加入SDS使蛋白质(包括DNase)变性,并加入蛋白酶K,降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸,及时阻止DNase的降解作用。
DNA分子很大、很长,在水中呈黏稠状,但DNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠,使之DNA分子具有刚性,即分子是僵直的(stiff),小角度的折叠和压挤等剪切力,将使DNA断裂成碎片。为保证获得大分子DNA,操作时应避免急裂振摇,或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的吸头,不可猛吸猛放,更不能用细的吸头反复吹吸。
大分子DNA的水溶液呈黏稠状,可以用玻璃棒缠起来。液体DNA只要防止DNase污染和高盐浓度条件下能在液体状态保存;抽干后的固体DNA,性质稳定,可长期保存。
生物体内各部位的DNA是相同的,但取材时以含量丰富的部位为主,如动物的肝脏、脾、肾、血液、精子等。所有材料,必须新鲜及时使用,或放入-20℃冰箱或液氮冷冻保存。
DNA的含量及纯度可用紫外吸收法、定磷法及化学法等测定。
(二)试剂及器材
(1) 0.15mol/L NaCl – 0.015mol/L pH7.0柠檬酸钠溶液:称取8.77g NaCl,4.41g柠檬酸三钠(Na3C6H507 · 2H20),用约800ml蒸馏水溶解后,调节pH至7.0,最后定容至1 000ml。
(2) 0.15mol/L NaCl – 0.1mol/L EDTANa2溶液:称取8.77g NaCl,37.2g EDTANa2溶于约800ml蒸馏水中,以NaOH调pH至8.0,最后定容至1 000ml。
(3) 5%(W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液:称取5g SDS溶于45%(V/V)100ml的乙醇中。
(4) 氯仿– 异戊醇溶液:按氯仿:异戊醇=24:1配制。