ELISA试剂盒PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：ELISA试剂盒模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
实验材料 模板DNA
试剂、试剂盒 dNTP Taq DNA聚合酶 蒸馏水 PCR缓冲液 引物 氯化镁
仪器、耗材 PCR仪 移液枪 PCR板 薄壁管 离心管 离心管盒
实验步骤 一、标准的PCR反应体系
 

10×扩增缓冲液 　 10 ul

4种dNTP混合物 　 各200 umol/L

引物 　　　　 　 各10～100 pmol

模板DNA 　　　 　0.1～2 ug

Taq DNA聚合酶 　 2.5 u

Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L

加双或三蒸水至 　 100 ul

二、PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

1. 引物设计的基本原则

（1） 引物长度：15-30 bp，常用为20 bp左右。

（2） 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

（3） 引物内部不应出现互补序列。

（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

（5） 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有*互补序列，否则易导致非特异性扩增。

（6）引物3‘端的碱基，特别是zui末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，*选择是G和C。

（7） 引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

2. 引物设计软件

Primer Premier5.0 （自动搜索）*、Oligo6 （引物评价）、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 （在线服务）。

三、模板的制备

（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

（2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

（3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

四、PCR反应条件的控制

1. PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子 。

2. 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。
　　
3. 底物浓度dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 umol/L。
　
4. TaqDNA聚合酶2.5U（100 ul）。
　　
5. 引物 浓度一般为0.1 ～0.5 umol/L。
　
6. 反应温度

（1）变性温度和时间95℃，30 s。

（2）退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。

（3）延伸温度和时间72℃，1 min/kb（10 kb内）。

（4）Tm值=4（G+C） +2（A+T）

7. 循环次数 ：一般为25 ～30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

五、PCR的循环参数

1. 预变性（Initial denaturation）

模板DNA*变性与PCR酶的*激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2. 循环中的变性步骤

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列*变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间，变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不*，易造成扩增失败。

3. 引物退火（Primer annealing）

退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4. 引物延伸

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶zui适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略

延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

5. 循环数

大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。

6. zui后延伸

在zui后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸*，并使单链产物退火成双链。

六、PCR步骤

1. DNA变性

（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。

2. 退火

（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3. 延伸

（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性*）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

七、PCR检测

PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是zui常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。展开
注意事项 1. 由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。样品间的相互污染可能产生假阳性结果，特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。

2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。

3. 不使用过量试剂“less is usually better （more specific）”。

4. 试剂购回后应分装成小份使用，这样一旦有污染发生，可以立即丢弃污染的试剂，不会造成大的损失；试剂分装也有助于减少反复冻融次数（例如dNTPs对反复冻融敏感）。

5. 加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以保证充分混匀。

6. 使用阴性对照检查污染的发生。

7. 使用阳性对照（能良好扩增的样本）。

8. 电泳时使用DNA分子量标准品（指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败）。

9. 当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二级结构的模板时适量使用添加剂（glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度；glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用；DMSO 减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性）。

10. 不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶（避免反复冻融），每次取酶时都使用新的枪头酶，酶使用后应立即放回冰箱。酶要在加完缓冲液后再加，直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。

11. PCR产物的电泳检测时间，ELISA试剂盒一般为48 h以内，有些于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。