PCR反应扩增产物平端连接法实验详述
时间：2024-08-12 阅读：699
实验原理：
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。
这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。
对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X-gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。
1. 依次混匀下列试剂
（1）H2O：35 μl
（2）10×PCR反应缓冲液：5 μl
（3）25 mmol/L MgCl2：4 μl
（4） 4种dNTP：4 μl
（5）上游引物（引物1）：0.5 μl
（6）下游引物（引物2）：0.5 μl
（7）模板DNA（约1 ng）：0.5 μl
（8）混匀后离心5秒。
2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5 μl约2.5 U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
二、电泳
取10 μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
三、PCR产物的纯化
扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。
1. 酚/ lv仿法
（1）取反应产物加100 μl TE。
（2）加等体积lv仿混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。
（3）再用酚:lv仿:抽提二次，每次回收上层水相。
（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。
（5）在小离心机上10000 rpm离心10 min，吸净上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddH2O 中，待用。
2. Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：50 ml Wizard PCR DNA纯化树脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 Wizard微型柱。
（1）吸取PCR反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
（2）加100 ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
（3）加1 ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。
（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。
（5）将注射器与微型柱分开，取出注塞， 再将注射筒与微型柱相连，加入2 ml 80%异丙醇，对微型柱进行清洗。
（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。
（7）将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50 μl TE或水，静止1分钟后，12 000 g离心20秒。
（8）丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。
四、载体加dT尾
1. 将1 μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2. 在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，除将4 μl 4种dNTP改为4 μl 25 mM dTTP。
3. 加入1 μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2 h。
4. 按前面三中所述，用酚:lv仿:抽提二次。
5. 加入2倍体积 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。
6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
五、PCR产物与载体粘末端连接
1. 在7 ml PCR产物中加1 ml带dT尾的pUC质粒。
2. 加1 ml T4DNA连接酶，1 ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。
3. 取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
1. 在50 ml的PCR产物中，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混匀。
2. 37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。
3. 用酚:lv仿抽提2次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddH2O中。
5. 质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1 ml （约0.1 mg）加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1 ml ，连接缓冲液1 ml 。
6. 取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
2. PCR非常灵敏， 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
3. 吸头、离心管应高压灭菌， 每次吸头用毕应更换， 不要互相污染试剂。
4. 加试剂前， 应短促离心10秒钟， 然后再打开管盖， 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
5. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
6. 纯化树脂在使用前必须充分混匀。
7. PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。
如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。
通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。
这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。
对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X-gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。
实验步骤：
一、PCR反应1. 依次混匀下列试剂
（1）H2O：35 μl
（2）10×PCR反应缓冲液：5 μl
（3）25 mmol/L MgCl2：4 μl
（4） 4种dNTP：4 μl
（5）上游引物（引物1）：0.5 μl
（6）下游引物（引物2）：0.5 μl
（7）模板DNA（约1 ng）：0.5 μl
（8）混匀后离心5秒。
2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5 μl约2.5 U），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
二、电泳
取10 μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
三、PCR产物的纯化
扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。
1. 酚/ lv仿法
（1）取反应产物加100 μl TE。
（2）加等体积lv仿混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。
（3）再用酚:lv仿:抽提二次，每次回收上层水相。
（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。
（5）在小离心机上10000 rpm离心10 min，吸净上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddH2O 中，待用。
2. Wizard PCR DNA纯化系统
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：50 ml Wizard PCR DNA纯化树脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 Wizard微型柱。
（1）吸取PCR反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
（2）加100 ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
（3）加1 ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。
（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。
（5）将注射器与微型柱分开，取出注塞， 再将注射筒与微型柱相连，加入2 ml 80%异丙醇，对微型柱进行清洗。
（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。
（7）将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50 μl TE或水，静止1分钟后，12 000 g离心20秒。
（8）丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。
四、载体加dT尾
1. 将1 μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2. 在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，除将4 μl 4种dNTP改为4 μl 25 mM dTTP。
3. 加入1 μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2 h。
4. 按前面三中所述，用酚:lv仿:抽提二次。
5. 加入2倍体积 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。
6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
五、PCR产物与载体粘末端连接
1. 在7 ml PCR产物中加1 ml带dT尾的pUC质粒。
2. 加1 ml T4DNA连接酶，1 ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。
3. 取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
1. 在50 ml的PCR产物中，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混匀。
2. 37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。
3. 用酚:lv仿抽提2次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddH2O中。
5. 质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1 ml （约0.1 mg）加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1 ml ，连接缓冲液1 ml 。
6. 取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
注意事项：
1. PCR反应液可直接用于连接，但最好对PCR产物纯化后进行连接，既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。2. PCR非常灵敏， 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
3. 吸头、离心管应高压灭菌， 每次吸头用毕应更换， 不要互相污染试剂。
4. 加试剂前， 应短促离心10秒钟， 然后再打开管盖， 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
5. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
6. 纯化树脂在使用前必须充分混匀。
7. PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。