ELISA试剂盒中HRP底物范围较广，HRP即辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以zui 常用。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。HRP底物主要包括二氨基联苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。

一、二氨基联苯胺／金属盐

DAB是辣根过氧化物酶最敏感、常用的底物。它产生强烈的棕色产物，在水和醇中不溶解。多数情况下，推荐在DAB中加入不同的金属离子。当加入金属盐如钴、镍至底物液中，辣根过氧化物酶可以更加敏感。此类反应产物呈暗蓝灰色至黑色，且在水及醇中稳定。DAB／金属盐染色应用的组织染色范围较广。

1.     需要的溶液和特殊设备

DAB，0.05 mol／LTris缓冲液(pH7.6), 0.3％ (W/V) 氯化镍/水贮存液, 30％过氧化氢, DPX, 光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果).

2.     操作步骤

(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris缓冲液(pH7.6)溶解6 mg DAB；

(2) 加 l mL 0.3％(W/V)氯化镍/水贮存液(也可以用等量的氯化钴替代)；

(3) 加0.1 mL 3％过氧化氢。过氧化氢一般以30％的溶液提供，贮存在4 ℃，此条件可以持续1个月；

(4) 如果出现沉淀，用滤纸过滤；

(5) 加此溶液至标本，并孵育1~20 min水洗终止反应；

(6) 优化：如果需要可复染；

(7) 用DPX封片。

二、氯萘酚

氯萘酚可以形成一种蓝黑色产物。敏感性低于DAB，且产物可溶于醇中。它适用于当DAB反应形成较高背景或要求改变产物的颜色。

1.     需要的溶液和特殊设备

0.03％氯萘酚，用无水乙醇溶解(贮存在-20℃)，0.05 mol／LTris(pH7.6)，过氧化氢，Gelvatol或者Mowiol，光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。

2.     操作步骤

(1) 氯萘酚贮存液的准备：用10 mL无水乙醇溶解0.3 g氯萘酚，贮存于-20℃；

(2) 加100 μL 氯萘酚贮存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6)；

(3) 加0.1 mL 3％过氧化氢于水中。过氧化氢一般是以30％的溶液提供，4℃可存放1个月；

(4) 白色沉淀可用滤纸过滤去除；

(5) 加此溶液到标本中，并在室温孵育10～40 min，水洗终止反应；

(6) 优化：如果需要，进行复染，但只可使用水溶性染料；

(7) 用Gelvatol或者Mowiol封片。

三、氨乙基咔唑

氨乙基咔唑(AEC)产生红色产物，其敏感性低于DAB，但可用于DAB反应产生较高背景或要求改变产物颜色的实验。此产物可溶于醇，但不溶于水。

1.     需要的溶液和特殊设备

0.4％ AEC用 N,N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解， 0.1 mol/L乙酸钠缓冲液(pH5.2)，过氧化氢， Gelvatol或Mowiol，光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。

2.     操作步骤

(1) 用 l mL DMF溶解 4 mg AEC。AEC在DMF中稳定，因此，可以用100 mL DMF溶解0.4 g AEC作为贮存液备用；

(2) 加 l mL AEC溶液至15 mL 0.1 mol/L的乙酸钠缓冲液(pH5.2)中，并搅拌；

(3) 加0.15 mL 3％过氧化氢于水中。过氧化氢一般是30％的溶液提供，在4℃可存放1个月；

(4) 用滤纸过滤；

(5) 加此溶液到标本中，并于室温孵育10～40 min，水洗终止反应；

(6) 优化：如果需要复染，只可用水溶性染料；

(7) 用Gelvatol或Mowiol封片。