PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
 

　　1.  引物的特异性
 

　　引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
 

　　2.  避开产物的二级结构区
 

　　某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能(△G°)小于58.6 lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
 

　　3.  长度
 

　　寡核苷酸引物长度为15~30 bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2(G+C)+(A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性。
 

　　4.  G+C含量
 

　　G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
 

　　5.  碱基础随机分布
 

　　引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
 

　　6.  引物自身
 

　　引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
 

　　7.  引物之间
 

　　两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
 

　　8.  引物的3′端
 

　　引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中，引物3′端不能发生错配。
 

　　在标准PCR反应体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP(四种dNTP各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。
 

　　9.  引物的5′端
 

　　引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
 

　　10.  密码子的简并
 

　　如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
 

　　特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。