PCR（Polymerasechain reaction，聚合酶链式反应）是模拟体内DNA复制过程，对特定DNA序列进行大量扩增的一种技术。 PCR反应是以4种dNTP为底物，引物引导，DNA聚合酶催化作用下，在单链DNA模板3’末端开始进行互补链的延伸，多次反复的扩增使特定DNA序列以指数增加。

一、PCR反应特点：

1、强特异性

PCR反应的特异性决定因素为：

（1）引物与模板DNA特异性的结合；

（2）碱基配对原则；

（3）Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

（4）目标基因序列的特异性与保守性。 

2、 高灵敏度

在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，其灵敏度可达到白万分之一。

3、 快速简便

PCR反应可在PCR仪上进行，一般在2～4小时完成。如采用特殊PCR仪（荧光时时定量PCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短。

二、PCR反应流程

PCR循环过程包括三部分：模板变性、引物退火、DNA链延伸合成。

1 、模板DNA的变性

模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，以便它与引物结合。变性温度低则变性不*，dna双链会很快复性，因而减少产量。变性温度不能过高，变性时间应尽量缩短，以保持taqdna聚合酶的活力。PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段进行热启动。

2 、模板DNA与引物的退火

将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物，即复性。退火温度决定PCR产物的特异性与产量。退火温度高，特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；退火温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般实验中退火温度T_a(annealing temperature)比扩增引物的解链温度T_m(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算：T_a =T_m-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃。在反应体系中引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并且引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多。退火时间一般为1～2min。

3、 引物的延伸

DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。引物延伸温度的选择取决于DNA聚合酶的最适温度, 一般为70～75℃。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。一般在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒,其速度取决于缓冲溶液的组成、ph值、盐浓度与DNA模板的性质。

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算。

Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%。反应初期，目的DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台效应。

PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。引物如果跟原始DNA模板结合，从3'端开始扩增延伸，其产物的5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。引物如果是以新合成的DNA链（即“长产物片段”）为模板扩增时，模板的5'端序列是固定位置的，即新合成延伸链的3'端是固定的，使新合成DNA链的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。由于新合成的DNA链在下一个循环反应中可以作为引物结合扩增的模板，“短产物片段”是按指数倍数增加。而原始DNA模版的量是固定的，“长产物片段”只按算术倍数增加，在最终PCR中的含量几乎可以忽略不计。

一般PCR反应包括上述变性-退火-延伸三个温度点。但在扩增某些较短目标序列（长度为100～300bp时）时，可采用二温度点法，即把退火与延伸温度合二为一。

4、 循环次数

PCR循环次数一般为25～40个。循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。循环反应的次数太少，则产率偏低。