上海武昊公司*：071409Ra， ELISA Kit for Hemoglobin （HB）

仅供体外研究使用，不用于临床诊断!

[预期应用]

本试剂盒运用双抗体夹心ELISA法定量测定血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清 或其它相关生物液体中待检测指标含量。

[试剂盒内容]

[标本的采集与保存]

1、 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4^oC过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20^oC或-80^oC保存，但应避免反复冻融。

2、 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8^oC 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20^oC或-80^oC保存，但应避免反复冻融。

3、 组织匀浆：

1） 取适量组织块，于预冷PBS（0.02mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，称重后备用（组织块较大需先剪碎后再匀浆）；

2） 可同时选用多种匀浆方法达到较好的破碎效果：首先将组织块移入玻璃匀浆器，加入5-10mL预冷PBS进行充分研磨，该过程需在冰上进行（有条件实验室可选用机器匀浆）；得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理（超声破碎过程中注意冰浴降温；反复冻融法可重复2次）。

3） 将制备好的匀浆液于5000×g离心5分钟，留取上清即可检测。

4、 细胞培养上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20^oC或-80^oC保存，但应避免反复冻融。

注意：

1、 以上标本均需密封保存，4^oC保存应小于1周，-20^oC不应超过1个月，-80^oC不应超过2个月。

2、 标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

3、 标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。[操作步骤]

1、 加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品（见试剂准备2）。空白孔加100μL（见试剂准备第二步zui后一管），余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37^oC温育2小时。

2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。

3、 每孔加检测溶液A工作液100μL（临用前配制），酶标板加上覆膜，37^oC温育1小时。

4、 弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次（也可轻拍将孔内液体拍干），重复洗板3次。zui后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液*甩干。自动洗板机亦可。

5、 每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100μL，加上覆膜，37^oC温育30分钟。

6、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4。

7、 每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37^oC避光显色（反应时间控制在15-25分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。

8、 每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。

9、 在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（O.D.值）。

注意：

1、 试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。

2、 加样：实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，*个孔与zui后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此，一次加样时间（包括标准品及所有样品）控制在10分钟内。*设置复孔进行实验。

3、 温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。

4、 洗涤：充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液*甩干。洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响zui后的酶标仪读数。如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实 验过程中。

5、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10分钟观察一次），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

6、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

7、 如果实验室内湿度低于60%，*使用加湿器提高湿度水平。

[实验原理]

将待检测抗体包被于96孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的待检测指标与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的待检测抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP标记的亲和素，再次*洗涤后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的待检测指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓度。

仅供参考，以随货说明书为准，更多产品如酶联免疫试剂盒（ELISAkit；ELISA 试剂盒）；化学发光试剂盒（CLIA试剂盒；CLIAkit） ；抗体（antibody）；蛋白（protein）；鲎试剂；内毒素工作标准品；内毒素指示剂；无热原检查用水；无热原吸咀；紫外灯；色谱仪；色谱柱等详情信息请登录上海武昊公司*