ELISA的影响因素 这是ELISA检测中的重要部分，可从9个方面加以说明。
（一）固相载体：可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、琼脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中zui常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。由于微量反应板所用试剂量少，操作方便，适合于大规模应用。国产聚苯乙烯微量反应板（上海塑料三厂出品）目前已大量应用于ELISA测定，并且获得了满意的结果。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚至*丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须经过实验室鉴定，鉴定的方法和标准是对每批购置的微量反应板或塑料管抽样，用0.2ug/ml纯化的正常人IgG进行包被，经洗涤后加酶标记抗人球蛋白进行反应，再经孵育洗涤，加底物显色终止反应后，逐孔在酶标比色计中测定其消光值、光密度（O.D值）。一般认为全板中每两孔间O.D值的误差不超过10%为合格。如果中间孔与四周孔O.D值相差太大，或者反应板的这一边与另一边凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，还要检查阳性和阴性参考血清O.D值是否有明显差别。一般要求有10倍左右的差异为合格，微量反应板或塑料管在使用前并不一定通过特殊处理。用蒸馏水冲洗即可应用。
（二）抗原：在ELISA的影响因素 中，包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结果都有影响。包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考虑到制备包被抗原不应破坏其免疫学活性。经试验证明，适用于其他血清学试验的抗原并非均适合用于ELISA法。因此，对某一疾病的诊断，必须通过实践，才能选出适用的抗原。对大多数传染病和寄生虫病的血清学诊断中所用的抗原并非要求十分严格，一般能用于补体结合试验的可溶性抗原均可用于ELISA，例如超声波抗原、冻融抗原、细菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、细菌的外毒素以及用表面活性剂（如SDS）所提取的抗原等，在作ELISA时，必须要有1-2种试剂、要求纯化，但用表面活性剂提取的抗原在包被前必须透析除去表面活性剂，否则就不易吸附到固相载体上去。此外，对某些抗原必须进行提纯，如病毒的组织培养和鸡胚培养物以及病毒接种动物的脏器等，它们当中存在着许多非抗原的蛋白质，必须设法除去，常用梯度超速离心或亲和层析法提纯，不经提纯是不能使用的。在用特异性抗体包被固相载体时也要提纯。用抗原或抗体蛋白包被固相载体时选择的浓度要适当。如浓度太高，则低效价抗体可能测不出来，或包被过量形成多层抗原吸附，故在操作过程中可能脱落从而降低敏感性和可重复性。用zui适稀释度抗原，包被固相载体不仅经济，而且可以克服前带现象。那么用多大浓度抗原进行包被zui为合适呢？可通过棋盘滴定法进行测定，但用单项滴定法更为简便，其方法是将抗原进行一系列稀释包被微量反应板，再用一定稀释度的阳性参考血清和阴性参考血清进行孵育后洗涤，再加酶结合物进行反应，经孵育洗涤后，加底物溶液显色，终止反应后分别测定O.D值，选择O.D值≥1.0的那个抗原稀释度为zui适包被浓度。一般总是要选择那个O.D值稍大于1.0，而不选择小于1.0的抗原浓度。阴性参考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求阳性参考血清和阴性参考血清的O.D值有明显差别。抗原包被固相载体除浓度外，对时间、温度、PH均有关系。温度高（如37℃、45℃、或56℃），包被时间可缩短，温度低可延长包被时间。但为了方便起见，通常采用4℃包被过夜，可使抗原吸附得更加*且均匀。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反应板或塑料管作固相载体时，在碱性条件下（如0.1mol/L、PH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原）4℃包被过夜较为合适。但在某些试验中，如用LPS或毒素蛋白包被时，用
PH 7.2-7.4 PBS稀释才是满意的。包被特异蛋白质的浓度为1-10ug/ml，而对某些病原微生物抗原以5-20ug/ml较为合适，但均应通过滴定。
（三）ELISA的影响因素 试验样品：血清、血浆或其他体液，均可作为ELISA的试验样品（标本）。但应注意分离血清时，血液要求放置室温中凝固收缩，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否则会使大部分IgM和少量IgG丧失活性。关于人血清在保存过程中抗体的稳定性报导尚不多。但一般认为作ELISA血清要新鲜，若要贮藏，必须少量分装保存于低温冰箱，并防止反复冻融。血浆可用肝素毛细管法采血，而血清可用滤纸片法采血。
被检血清或血浆标本，可用含保护性封阻剂（吐温-20）或称湿润剂的缓冲液来稀释。也可加入一些蛋白质，如1%牛血清白蛋白等来稀释。然后再加到已经用抗原或抗体包被的固相载体中进行孵育。此种被试标本可作一系列稀释度测定，也可用一个稀释度测定。对于作某一个传染病的诊断来说，先用一系列稀释度作一批标本测定，求出对诊断有意义的一个稀释度（即测定剂量反应曲线），然后用一个稀释测定即可。zui适稀释度和孵育时间均需从实践中摸索出来，对一般病原微生物所引起的传染病的血清学诊断，以1：200稀释度测定比较适当，而试验标本的（即含抗体）作用时间一般为室温或37℃ 1-2小时。但现在对有些标本（如流脑抗原）测定时，仅用37℃ 5分钟。对单克隆抗体检测也可缩短作用时间。
（四）结合物：在ELISA中，用酶标记的抗体或抗原统称为结合物，此为进行ELISA检测的关键试剂。常规使用ELISA法的主要问题是能够简便地制备酶结合物，而此种制备好的酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。
用什么样的酶来标记抗原或抗体呢？可根据以下几点来选择适当的酶。
1、酶制品的纯度及活力高，催化效力也高，放大倍数大（即一个酶分子能催化几十几百个底物分子发生反应的酶）。
2、酶及制备好的酶结合物在检测或贮存中能保持稳定。
3、酶制剂易得、价廉.
4、既要适用于标记抗原，又适用于标记抗体，标记后不影响抗原或抗体的免疫学特性，也不降低酶的活性。
5、酶的反应产物稳定，检测时简便、快速。在定量测定中产物必须是可溶性的。
6、要有安全、价廉、易得的底物。
符合上述条件的酶有：碱性磷酸酶，一般用分子量为5×105（Alkaline Phospatase,简称AP），辣根过氧化物酶（Horse Radish Peroxidase,简称HRP,分子量为4×104）,另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰胆碱酯酶等等。其中以前两种（AP和HRP）ELISA的影响因素 zui为常用。